一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法技术

本发明专利技术公开了一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，包括以下步骤：①样品前处理；②样品检测；③S‑(‑)‑烟碱和R‑(+)‑烟碱的定量测定。本发明专利技术的分离测定方法首次采用了反相二维液相色谱体系，稳定性大大提高；本发明专利技术还提供了一种含烟碱的样品或纯烟碱样品中烟碱来源的辅助识别方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法
本专利技术属于分析化学领域，具体涉及一种基于反相二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法。
技术介绍
烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，是烟草最重要的生理性活性成分。烟碱分子含有一个手性中心，有两个旋光体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱，两者在烟草中含量、代谢机理和生理特性完全不同。已报道的烟碱手性分离方法主要有毛细管电泳法、核磁共振法(NMR)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱(GC)及其联用法等。烟碱旋光异构体的构成比例是烟草特征性成分之一。2018年发布了烟草行业标准YC/T561—2018《烟草特征性成分烟碱旋光异构体比例的测定高效液相色谱法和超高效合相色谱—串联质谱法》，推荐了两种烟碱旋光异构体比例的测定方法，即正相手性柱分离的高效液相色谱法和超高效合相色谱—串联质谱法。这两种测定方法的色谱体系受试剂和环境中水分影响较大，保留时间不稳定；同时由于液相色谱方法反相色谱和正相色谱之间溶剂体系切换所需时间长，而且对仪器稳定性影响较大，不利于实验室多种方法的开展和仪器维护。另外，由于烟碱两个对映体含量差别较大，对测定方法的灵敏度要求较高，对于较为复杂的基质，有效排除杂质干扰是方法准确度的保证；标准所推荐的两种测定方法难以达到要求。为解决上述问题提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术首次提出了基于反相二维液相色谱分离烟草及烟草制品中烟碱的旋光异构体的测定方法。通过在一维柱中对烟碱的富集、净化和精准切割，再在二维液相中进行手性分离，有效解决了烟草复杂基质的干扰，方法稳定性好，灵敏度高，适用于富杂基质中烟碱的旋光异构体的分离和测定。本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一方面公开了一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，包括以下步骤：①样品前处理：将样品加入适量甲醇中萃取，取上层清液得待测液；②样品检测：将步骤①得到的待测液进行反向二维液相色谱检测，采用峰面积归一化法测定待测液中的碱旋光异构体即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的相对含量；③S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定量测定：配制标准工作溶液，建立S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱建立线性回归方程，对待测液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱进行准确的定量分析。优选地，所述的样品包括烟叶、烟丝、传统卷烟、加热卷烟、电子烟烟油或烟草提取物中的一种。优选地，步骤①中的烟草样品与甲醇的固液比为1:10～1:200(g:mL)，萃取方式为振荡萃取、超声萃取中的一种，萃取时间为10～180min。优选地，步骤②中液相色谱条件如下：一维色谱柱：AgilentInfinityLabPoroshellHPH-C18，(4.6*50mm，2.7μm)；流速1mL/min；流动相A：50mmol/L的醋酸铵溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱，洗脱顺序见下表：梯度洗脱顺序定量环，40～500μL；二维液相色谱柱：AgilentInfinityLabPoroshellChiral-T，(4.6*150mm，2.7um)；流动相包括：甲醇＝45v/v％，乙腈＝55v/v％；流速1mL/min。优选地，所述二维液相色谱柱的流动相还含有0.25v/v％的醋酸及0.05v/v％三乙胺。优选地，步骤②中所用仪器为光电二极管阵列检测器，其参考检测波长为255～265nm，柱温箱：25～35℃，进样量：2～5μL。优选地，步骤②中检测步骤包括：一维色谱柱对进样样品进行初步分离富集净化，目标物在一维色谱柱出峰的时间段内通过切换阀进行精准切割，切割后的目标物进入定量环保留；然后二维流动相将目标物从定量环转移至二维液相色谱柱，实现对烟碱同分异构体的分离。二维液相色谱柱为二维手性色谱柱。优选地，步骤③中的标准工作溶液的配制使用的溶剂为甲醇、异丙醇中的一种。本专利技术第二方面公开了所述的方法用于含烟碱的样品中烟碱来源的辅助识别方法的用途。相对于现有技术，本专利技术具有以下显著优点：1、本专利技术的分离测定方法，采用了反相二维液相色谱体系，克服了基于正向液相色谱的烟碱的旋光异构体分析体系中试剂和环境中水分对体系的影响较大的缺点，稳定性大大提高。2、本专利技术的分离测定方法，在一维柱中对烟碱进行富集、净化和精准分离切割，再在二维柱中进行手性分离，有效解决了烟草复杂基质的干扰；操作简单、稳定性好、灵敏度高、准确度好、分析时间短，适用于复杂基质中烟碱旋光异构体的分离及定量测定。3、本专利技术的方法提供了一种用于含烟碱的样品或纯烟碱样品中烟碱来源的辅助识别方法的用途；2％的R-(+)-烟碱旋光异构体比例大致可以作为样品中烟碱可能来源于烟草提取的识别指标。附图说明图1为本专利技术的在线中心切割的二维液相系统切换流路示意图。图2为实施例3晒黄烟的烟叶中烟碱旋光异构体的二维液相色谱图。图3为不同来源的烟草中R-(+)-烟碱旋光异构体比例。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术的技术方案作进一步地说明，但本专利技术的保护范围并不限于此。(1)仪器与试剂Agilent1260-Agilent1290二维液相色谱仪(美国Agilent公司)；Milli-Q-Intergral5超纯水仪(美国Millipore公司)；SHZ-88水浴恒温振荡器(金坛市医疗仪器厂)；BT125D电子天平(感量0.0001g，德国赛多利斯科学仪器有限公司)；KQ-700DB数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；具塞离心管，50mL；一次性无菌注射器；5mL；有机相滤膜，0.22μm(上海楚定分析仪器有限公司)。甲醇(色谱纯，德国Merck公司)，乙腈(色谱纯，德国Merck公司)，三乙胺(分析纯，南京化学试剂有限公司)，乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、乙酸铵，二乙胺(分析纯，廊坊鹏彩精细化工有限公司)、甲酸铵(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)、外消旋体烟碱标准品(纯度＞90％,加拿大TRC公司)，左旋烟碱(S-(-)-烟碱)和右旋烟碱(R-(+)-烟碱)标准品(纯度＞99％，加拿大TRC公司)；烟草样品均由云南中烟工业有限责任公司技术中心提供；卷烟样品为市售卷烟。(2)系列标准工作溶液配制根据需要配制合适浓度的系列标准工作溶液，配制0.025、0.05、0.1、0.25、0.500mg/mL的左旋烟碱(S-(-)-烟碱)标准工作溶液。配置得到浓度为0.0002、0.0005、0.01、0.02、0.05mg/mL的右旋烟碱(R-(+)-烟碱)系列标准溶液，各级标准工作溶液即配即用。(3)样品制备取烟草样品磨粉后获得烟末样品，准确称取0.2g烟末样品，精确至0.0001g，放入50mL离心管中，加入30mL萃取剂甲醇密闭，放入超声波水浴中，于常温下超声萃取40min，过0.22μm有机相滤膜后进样分析。空白试本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n①样品前处理：将样品加入适量甲醇中萃取，取上层清液得待测液；/n②样品检测：将步骤①得到的待测液进行反向二维液相色谱检测，采用峰面积归一化法测定待测液中的碱旋光异构体即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的相对含量；/n③S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定量测定：配制标准工作溶液，建立S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱建立线性回归方程，对待测液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱进行准确的定量分析。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于二维液相色谱的烟碱旋光异构体分离测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
①样品前处理：将样品加入适量甲醇中萃取，取上层清液得待测液；
②样品检测：将步骤①得到的待测液进行反向二维液相色谱检测，采用峰面积归一化法测定待测液中的碱旋光异构体即S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的相对含量；
③S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定量测定：配制标准工作溶液，建立S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱建立线性回归方程，对待测液中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱进行准确的定量分析。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样品包括烟叶、烟丝、传统卷烟、加热卷烟、电子烟烟油或烟草提取物中的一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤①中的烟草样品与甲醇的固液比为1:10～1:200(g:mL)，萃取方式为振荡萃取、超声萃取中的一种，萃取时间为10～180min。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤②中液相色谱条件如下：
一维色谱柱：AgilentInfinityLabPoroshellHPH-C18，(4.6*50mm，2.7μm)；流速1mL/min；流动相A：50mmol/L的醋酸铵溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱瑞芝，司晓喜，王凯，蒋薇，刘志华，张凤梅，何沛，杨继，李振杰，向能军，刘春波，唐石云，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53