一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于检测核酸hly与代谢标志物乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；(2)双功能传感器标定或校准；(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度。本发明专利技术将检测不同标志物的方法集中于单一平台中，利用一个双功能传感器实现对单增李斯特菌不同标志物的同时检测和相互印证，增强了检测准确性，同时本发明专利技术方法将国标GB 4789.30‑2016中大约2～5天的单增李斯特菌鉴定时间缩短为约1.5小时，省时省功，具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法
本专利技术涉及一种检测单增李斯特菌的方法，尤其涉及一种基于检测核酸hly与代谢标志物乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法。属于电化学分析测试领域。
技术介绍
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性细菌，1926年在一种影响兔子和豚鼠的疾病中首次对该菌进行了描述。它在20世纪70年代被认为是一种人类疾病的发病因素，随后在80年代被确定为一种食源性病原体。李斯特菌病是一种由摄入受单增李斯特菌污染的食物引起的疾病，主要影响免疫功能低下的患者、孕妇和新生儿。在摄入受污染的食物后，单增李斯特菌会穿过肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障，引起胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产、妊娠并发症等。此外，单增李斯特菌可耐受较极端环境，如较宽的温度范围(1～45℃)、较宽的pH范围(4.5～9.6)、高盐浓度(10％～15％)等，这些特性使得单增李斯特菌可以与不同病原微生物共存于不同类型食物中，严重危害人类健康。因此，可靠、灵敏、准确地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是：/n(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；/n(2)双功能传感器标定或校准；/n(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度；/n其特征在于：/n步骤(1)所述基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备方法是：/n1)制备纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40±2℃温度下，腐蚀1小时，制得纳米多孔金薄膜，将制得的纳米多孔金薄膜固定在玻碳电极表面，真空干燥1～2小时后制得NPG/G...

【技术特征摘要】
1.一种基于检测核酸hly与乙偶姻的双功能传感器检测单增李斯特菌的方法，步骤是：
(1)基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备；
(2)双功能传感器标定或校准；
(3)以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度；
其特征在于：
步骤(1)所述基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器制备方法是：
1)制备纳米多孔金(NPG)/玻碳电极(GCE)：将厚度为100±10nm的Au/Ag合金片置于浓硝酸中，在40±2℃温度下，腐蚀1小时，制得纳米多孔金薄膜，将制得的纳米多孔金薄膜固定在玻碳电极表面，真空干燥1～2小时后制得NPG/GCE电极；
2)制备ssDNA/NPG/GCE电极：将与hly基因部分互补且末端修饰有巯基的捕获探针ssDNA溶于超纯水中，制得浓度为0.5～3μM的ssDNA溶液，然后将NPG/GCE电极浸入ssDNA溶液，在4℃孵育48～72小时后制得ssDNA/NPG/GCE电极；其中所述捕获探针ssDNA的序列为5’-TGGCGGCACATTTGTCACTGCA-(CH2)3-SH-3’；
3)制备双功能传感器BSA/ssDNA/NPG/GCE电极：将制得的ssDNA/NPG/GCE电极与浓度为m/v是0.5～5％的牛血清白蛋白(BSA)在4～30℃下孵育15～30分钟，制得基于检测单增李斯特菌核酸和代谢标志物的双功能传感器BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；
步骤(2)所述双功能传感器标定或校准的方法是：
1)核酸标志物hly检测：将培养好的浓度为104～109CFUmL-1的单增李斯特菌液，按不同浓度各取1～10mL，再以20～60千赫兹频率超声破碎细胞以及长链核酸，并与BSA/ssDNA/NPG/GCE电极在20～30℃孵育5～30分钟，制得hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；将hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极与5～40μM的亚甲基蓝(MB)在20～30℃孵育5～30分钟制得MB/hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极；将MB/hly/BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，放入50mM磷酸盐缓冲液的反应体系中，利用线性扫描伏安法，以20～100mVs-1的扫速在-0.5～+0.1V电压范围内检测，将得到的MB峰电流密度值对单增李斯特菌浓度作图，得到线性标准曲线；
2)代谢标志物乙偶姻检测：首先建立乙偶姻浓度对NADH降低量线性关系，将乙偶姻按0～500μM的不同浓度分别加入含有1～5mMNADH的50mM磷酸盐缓冲液反应体系中，以BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，以铂电极为对电极，以饱和甘汞电极为参比电极，利用线性扫描伏安法，以20～100mVs-1的扫速在+0.1～+0.7V电压范围内检测，将得到的NADH初始峰电流值作为对照(jNADH对照)；然后在缓冲体系中加入1～5mg异源表达的乙偶姻还原酶，在20～30℃反应5～30分钟，然后以BSA/ssDNA/NPG/GCE电极作为工作电极，利用线性扫描伏安法，以20～100mVs-1的扫速在+0.1～+0.7V电压范围内检测，将得到的反应后的NADH峰电流值记做jNADH反应，将jNADH对照减去jNADH反应，得到Δj，将检测不同浓度乙偶姻得到的Δj对乙偶姻浓度作图，得到乙偶姻浓度线性标准曲线；然后建立乙偶姻浓度对单增李斯特菌浓度线性关系，取1～50mL培养好的浓度为8.0×105～3.5×109CFUmL-1的单增李斯特菌液，以4000～8000rpm离心不同浓度菌液，收集培养基上清，加入50mM磷酸盐缓冲液反应体系，同时该体系加入终浓度为1～5mM的NADH，按照建立乙偶姻浓度对NADH降低量线性关系方法检测不同浓度单增李斯特菌上清中所含乙偶姻浓度，绘制乙偶姻浓度对单增李斯特菌浓度线性标准曲线；
步骤(3)所述以牛奶样品为例，基于双功能传感器利用加标回收方法检测牛奶中单增李斯特菌浓度的方法是：
取25mL成品牛奶加入到225mL适于单增李斯特菌生长的培养基中，命名为溶液1；从溶液1中取出0.1mL加入到10mL适...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，张亚超，许平，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37