一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术提供了塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、由所述重组核酸编码的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。本发明专利技术制备出了抗原产能高、致病性显著降低甚至对猪无致病性、抗体应答强、免疫保护率高等为特征的疫苗株，该疫苗株显著提高了生物安全性，可用于我国及周边国家塞内卡病毒的防控。

【技术实现步骤摘要】
一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种塞内卡病毒重组核酸、重组疫苗株及其制备方法和应用。
技术介绍
塞内卡病毒A(SenecavirusA,SVA)，也称塞内卡病毒(Senecavirus)、塞尼卡谷病毒(Senecavalleyvirus,SVV)，属于小RNA病毒科(Picornaviridae)塞内卡病毒属(Senecavirus)，也是该属的唯一成员。该病毒感染猪能够引起猪的原发性水泡病，与口蹄疫、猪水泡病和水泡性口炎等引起的临床症状难以区分。SVA感染后能引起断奶仔猪、保育、育肥和繁殖的各年龄段的猪发生水泡性病变，同时伴随跛行、发热、厌食、嗜睡等临床症状，新生仔猪除了上述症状外，还可能存在持续的腹泻、脱水等症状，甚至会突然死亡。塞内卡病毒是2002年由美国科研人员从细胞培养基污染物中首次分离到的。最初，并未将SVA与任何疾病关联，而是利用SVA具有的溶瘤特性，研究该病毒对人类癌症的治疗，直至2007年研究人员发现SVA能够感染猪并引起猪自发性水泡病(PIVD)。自2014～2015年以来，SVV先后在多个国家开始大范围流行，传播速度和致病力均比此前报道的有所增强，防控形势依然严峻。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种塞内卡病毒重组核酸、包含所述重组核酸的塞内卡重组病毒、由所述重组核酸编码的塞内卡重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。制备得到的疫苗株抗原产能高、致病性显著降低甚至对猪无致病性、抗体应答强、免疫保护率高，可显著提高生物安全性，可用于我国及周边国家塞内卡病毒的防控。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种塞内卡病毒重组核酸，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造。优选的，对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造后的5'UTR基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述塞内卡病毒株包括SVV/FJ/001株。本专利技术还提供了上述重组核酸在制备塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。本专利技术还提供了一种包含上述重组核酸的塞内卡重组病毒。本专利技术还提供了一种由上述重组核酸编码的塞内卡重组病毒。本专利技术还提供了一种包含上述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。优选的，所述塞内卡重组疫苗株能够激发动物对塞内卡病毒的免疫活性。优选的，所述塞内卡重组疫苗株对塞内卡病毒分离株的半数免疫保护剂量(PD50)的值均大于6。本专利技术还提供了上述塞内卡重组病毒的构建方法，包括如下步骤：(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S2片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；扩增所述S2片段的特异性引物对包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；(2)将所述S1片段和S2片段分别与pMD20T载体连接，得到亚克隆质粒PMD-S1和PMD-S2；(3)以所述亚克隆质粒PMD-S1为模板，用突变引物SVA-m5UTRF和SVA-m5UTRR进行扩增，得到亚克隆质粒PMD-mS1，所述SVA-m5UTRF的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示，所述SVA-m5UTRR的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；(4)将质粒PMD-mS1用PacI和SphI双酶切、质粒PMD-S2用SphI和NotI双酶切后，回收基因片段，连接替换插入到经PacI和NotI双酶切后的真核转录质粒prO/CHA/99中，得到所述重组质粒prSVV/FJ-M；(5)将得到的真核转录质粒prSVV/FJ-M转染塞内卡病毒敏感细胞，获得塞内卡重组病毒。优选的，步骤(3)所述突变后的5'UTR基因片段包括如SEQIDNO.1所示的核酸序列，或包括上述重组核酸。优选的，步骤(5)所述塞内卡病毒敏感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。优选的，在步骤(5)获得的所述塞内卡重组病毒，适用于悬浮细胞培养。本专利技术还提供了上述塞内卡重组病毒或利用上述方法制备得到的塞内卡重组病毒在制备塞内卡重组疫苗中的应用。本专利技术还提供了一种塞内卡重组疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)将塞内卡重组病毒接种至易感细胞内进行增殖培养，得到塞内卡重组病毒液；2)对所述塞内卡重组病毒液中的塞内卡重组病毒进行灭活和乳化，得所述塞内卡重组疫苗。优选的，步骤1)所述易感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞。优选的，步骤1)所述易感细胞包括BHK-21细胞、PK-15细胞、ST细胞、SK-RST细胞、IBRS-2细胞、H1299细胞或293T细胞的悬浮细胞。优选的，在进行步骤1)所述增殖培养时，所述塞内卡重组病毒的病毒滴度不低于106.5TCID50/mL。优选的，步骤2)中利用二乙烯亚胺进行所述灭活。优选的，所述二乙烯亚胺在所述灭活的体系中的浓度为1.5mmol/L。优选的，所述灭活的温度为30℃，灭活的时间为36h。优选的，步骤2)所述乳化时，将灭活后的塞内卡重组病毒与ISA206佐剂以体积比1:1混合。本专利技术还提供了利用上述制备方法制备得到的塞内卡重组疫苗。本专利技术还提供了上述塞内卡重组疫苗株或上述塞内卡重组疫苗在制备用于预防和/或控制动物由塞内卡病毒引起的相关疾病的药物中的应用。优选的，所述动物包括猪、牛或羊。本专利技术提供一种塞内卡病毒重组核酸、重组病毒、包含所述塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株及其制备方法和应用。依据塞内卡病毒分子流行病学及前期积累的流行毒株等资源，利用已建立的高效反向遗传操作技术平台，通过对SVV/FJ/001株基因分析，构建出对该病毒株基因缺失突变改造的全长cDNA，经过病毒拯救、重组毒株生物学特性测定、悬浮细胞培养适应、致病性研究、疫苗效力评价等，结果显示获得的塞内卡重组病毒除了具有病毒滴度高、能适应悬浮细胞培养等特点之外，其对猪的致病性显著降低，甚至对猪无致病性，显著提高了生物安全性，用该塞内卡重组病毒株制备的疫苗具有抗体应答好、免疫保护效力高等特点，该疫苗株显著提高了生物安全性，可用于我国及周边国家塞内卡病毒的防控，能够为控制该病的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造。/n

【技术特征摘要】
1.一种塞内卡病毒重组核酸，其特征在于，所述重组核酸的序列包括对塞内卡病毒株的5'UTR基因序列进行缺失突变改造。


2.权利要求1所述重组核酸在制备塞内卡病毒重组核酸或塞内卡重组疫苗株中的应用。


3.一种包含权利要求1所述的重组核酸的塞内卡重组病毒。


4.一种由权利要求1所述的重组核酸编码的塞内卡重组病毒。


5.一种包含权利要求3或4所述的塞内卡重组病毒的塞内卡重组疫苗株。


6.权利要求3或4所述的塞内卡重组病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以SVV/FJ/001株的cDNA为模板，利用特异性引物对分别扩增得到SVV/FJ/001株的S1片段和S2片段；扩增所述S1片段的特异性引物对包括上游引物和下游引物SVA-1R，所述上游引物包括SVA-1F0和SVA-1F；所述上游引物SVA-1F0的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述上游引物SVA-1F的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述下游引物SVA-1R的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；
扩增所述S2片段的特异性引物对包括上游引物SVA-2F和下游引物SVA-2R，所述上游引物SVA-2F的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，所述下游引物SVA-2R的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；
(2)将所述S1片段和S2片段分别与pMD20T载体连接，得到亚...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑海学，杨帆，朱紫祥，曹伟军，田宏，张克山，魏婷，郑敏，张伟，党文，马旭升，李丹，茹毅，何继军，郭建宏，刘湘涛，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62