牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2855制造技术

本发明专利技术属于动物传染病防制技术领域，涉及牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2855，突变株B2855含有牛分枝杆菌卡介苗LipQ的突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变位点位于基因组2757121位点后，位于为LipQ基因序列的564位点后，是一种新的结构基因和功能基因。本发明专利技术的突变株为低侵袭力，高胞内存活能力及高生长速度。突变株B2855保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2018865。本发明专利技术分离的突变基因及其突变株可望在牛分枝杆菌致病机理研究、免疫机制研究和制备防制牛结核病疫苗或药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2855
本专利技术属于动物传染病防制
，具体涉及一种牛分枝杆菌卡介苗低侵袭力突变株B2855，该突变株含有牛分枝杆菌卡介苗LipQ的突变体基因，相较于野生株，本专利技术的突变株为低侵袭力，高胞内存活能力及高生长速度。
技术介绍
牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis，Mtb)是一种人畜共患的胞内寄生菌，具有非常强的逃避宿主免疫应答并导致长期潜伏感染的能力，能够引起多物种的结核病，包括人。由于牛分枝杆菌与引起人结核病的主要病原结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)在基因水平上有99.95％的同源[1]，因此感染谱相互交叉，两者几乎可以感染所有的脊椎动物，并导致该病在人和动物之间的相互传播。目前用于预防人类结核病的唯一官方疫苗是牛分枝杆菌卡介苗(MycobacteriumbovisBacilleCalmette-Guerin，M.bovisBCG)，是牛分枝杆菌经实验室230次传代自然丢失其编码毒力因子的RD1区后而获得的减毒株。自1921年首次推出卡介苗，它为预防婴幼儿结核病，特别是结核性脑膜炎做出了重大贡献，但其对成人保护力却不稳定。尤其是对于许多特殊群体尤其是免疫低下群体(如艾滋病人)而言，卡介苗不仅无法实现其免疫保护功能，反而加速了结核病的发生。为解决这一问题，越来越多的学者致力于开发更为安全有效的结核病疫苗，但至今却仍没有优于卡介苗的疫苗问世。因此，从不同角度探讨开发出不影响卡介苗保护效力，且针对免疫低下群体更为安全的卡介苗具有十分重要的意义。细菌的毒力大小取决于其致病能力的强弱程度，一般情况下致病力越强，其毒力越强。细菌毒力大小通常从黏附、侵袭、复制、外毒素及免疫抑制等方面进行衡量。通过缺失毒力相关因子来降低卡介苗的毒力是制备安全疫苗的重要研究方向。侵袭是细菌感染宿主细胞、激发免疫学反应的重要一步。在分枝杆菌感染过程中，细菌最先被吸入肺泡腔，并与肺泡巨噬细胞互作，随后通过一系列通路或方式实现对宿主细胞侵袭[2]。侵袭力也因此成为了细菌的毒力相关因子，直接影响着细菌的毒力强弱，并与细菌的扩散密切相关[3]。当细菌侵入细胞，或细胞吞噬细菌后，细菌的胞内存活能力(在细胞内的复制水平)则可用来影射细菌毒力的大小。由侵袭相关基因所编码的侵袭相关蛋白直接影响着细菌的侵袭能力。因此，侵袭相关基因的筛选及鉴定，不仅有助于结核分支杆菌与宿主细胞互作机制的研究，更为新型卡介苗的研发奠定了重要的基础。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的缺陷，提供了一株重要的牛分枝杆菌低侵袭力突变体菌株(本专利技术中简称为突变株)B2888，该突变株涉及的基因为LipQ，相对于野生型牛分枝杆菌呈现明显的低侵袭能力、低胞内存活能力及高生长速度，所示性状与所插入失活基因的毒力相关。为了实现本专利技术的目的，申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原学分室从牛分枝杆菌卡介苗基因缺失突变体库中筛选得到一株侵袭能力显著降低的菌株B2855，该突变菌株含有LipQ基因，该基因编码一种与脂质代谢有关的羧酸酯酶。有文献报道认为，在结核分枝杆菌中，LipQ具有免疫抑制的作用，能够降低促炎因子的水平[4]。但在牛分枝杆菌中尚无文献报道其功能。经验证，在感染A549细胞过程中，突变菌株侵袭能力显著降低，胞内存活能力上升。在7H9培养基中，该突变菌株生长速度显著快于野生菌株。突变菌株与突变基因的关系研究显示突变菌株所述表型与失活基因LipQ的毒力相关。侵袭是细菌实现感染的重要步骤，病原菌毒力能够直接影响着宿主的免疫反应水平。因此，牛分枝杆菌卡介苗B2855突变株的成功构建及其所涉及基因LipQ相关功能的研究将对阐明牛分枝杆菌属成员的相关致病机制及开发更为安全有效的疫苗具有重要的参考价值。本专利技术的具体技术方案如下所述：申请人所用的牛分枝杆菌卡介苗为巴斯德株BCG【美国模式培养物保藏所(ATCC)：35734】为美国俄勒冈州立大学LuizBermudez教授馈赠。本专利技术的前期工作包括对保藏的牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株的复苏及培养。本专利技术以牛分枝杆菌卡介苗巴斯德株(ATCC：35734)为野生菌株，利用具有温敏特性的噬菌体MycoMarT7，将Himar1转座子转化到牛分枝杆菌卡介苗中，利用卡那霉素做抗性筛选标志，对突变菌株进行筛选，从而成功构建突变体库。本专利技术利用细胞侵袭模型从突变体库中筛选出侵袭能力降低的突变株，得到了侵袭能力降低显著的BCG突变菌株B2855(BCG::TnLipQ)，申请人将该突变株命名为MycobacteriumbovisBCGPasteurB2855，于2018年12月6日送交中国·武汉·武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO：M2018865。将本专利技术筛选的突变株B2855与牛分枝杆菌卡介苗野生株分别接种于7H9培养基中，进行胞内存活能力及生长曲线检测，结果显示突变株B2855具有高存活能力，且在对数生长期生长迅速。本专利技术构建的突变菌株涉及基因为LipQ，该基因编码一种与脂质代谢有关的羧酸酯酶，尚未检索到相关文献或数据库报道该基因在牛分枝杆菌中的功能。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的B2855菌株是专利技术人从牛分枝杆菌卡介苗突变体库中筛选获得的侵袭能力降低的突变株。2、本专利技术的B2855菌株已被专利技术人证实相对于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的胞内高存活能力。3、本专利技术的B2855菌株已被专利技术人证实相对于牛分枝杆菌野生菌株呈现显著的生长迅速表现。4、本专利技术所涉及的LipQ基因为牛分枝杆菌的一个新基因，该基因具有侵袭功能，能够降低细菌的胞内存活并提高生长速度。更详细的技术方案请参见《具体实施方式》。附图说明图1：是本专利技术的牛分枝杆菌卡介苗侵袭能力改变突变菌体高通量筛选部分结果。附图标记说明：图1中A图-F图分别是对突变体库中不同突变体进行筛选的结果，由于篇幅所限，仅对其中部分结果进行了展示。图1中的D图中的方框所示为低侵袭能力突变株B2855。整个实验中的“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01，“***”表示P<0.001。图2：本专利技术牛分枝杆菌卡介苗突变株B2855感染A549细胞后侵袭能力定量检测分析图。“***”表示P<0.001。B2855相较牛分枝杆菌野生株侵袭能力显著下调。图3：本专利技术牛分枝杆菌卡介苗突变株B2855所涉及LipQ基因的核苷酸序列(如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列一致)。图4：本专利技术牛分枝杆菌卡介苗突变株B2855所涉及基因LipQ的核苷酸序列(如序列表SEQIDNO:1所示的核苷酸序列一致)。其中在该基因的564位点、即基因组2757121位点后发生转座子插入失活。图5：本专利技术牛分枝杆菌卡介苗突变株B2855感染A549细胞后胞内存活能力定量检测分析图。附图标记说明：“*”表示P<0.05，“**”表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分离自牛分枝杆菌卡介苗突变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
20190416 CN 20191030562281.分离自牛分枝杆菌卡介苗突变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


2.一株牛分枝杆菌卡介苗的突变株B2855，其特征在于，该突变株的突变基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，其突变位点在位于牛分枝杆菌基因组位点2757121后，且位于LipQ基因序列的564位点后；包含SEQIDNO:1序列的突变株B2855保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2018865。
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈颖钰，师红铃，郭爱珍，李倩倩，郭佳成，胡长敏，陈焕春，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42