一种单分子多组分数字免疫分析方法技术

一种单分子多组分数字免疫分析方法，属于生物化学与医学检测技术领域。本发明专利技术以多色荧光微球、磁纳米颗粒形成免疫复合物，以液滴分装免疫复合物，激光为激发光源，检测液滴中的荧光。荧光微球受激发射的荧光波长反映了所用抗体的种类，也即反映了抗原种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。该方法可以用于检测血液样品中多个肿瘤标志物的同时高灵敏检测，且检测限在aM到fM的水平。

【技术实现步骤摘要】
一种单分子多组分数字免疫分析方法
本专利技术涉及一种单分子多组分数字免疫分析方法，属于生物化学分析与传感

技术介绍
实现重大疾病早期筛查、早期诊断的支撑技术是精准医学测量。蛋白质分子是医学测量的重要对象，也是疾病检测和诊断的重要标志物。免疫技术是临床检验中蛋白检测的重要医学测量分析手段，在疾病诊断、肿瘤标志物筛选、药物分析等领域中发挥着不可替代的作用。常规免疫技术对于已经发生明显症状的疾病诊断十分有效，但难以满足重大疾病早筛、神经障碍早诊、心血管疾病早检等需求，尚不能达到精准医学测量的水平。这是因为常规免疫技术灵敏度偏低，检测限偏高，仅能检测到血液中nM-pM浓度的抗原分子，而在重大疾病的早期阶段，血液中抗原浓度在fM级别甚至更低，常规免疫分析根本测量不到，更遑论精准测量。因此提高免疫技术的灵敏度至飞摩级别是实现精准医学测量的必要条件之一。实现精准医学测量的另一个必要条件是多组分免疫分析。多组分免疫分析是指同时完成同一样品中两种以上抗原的免疫分析方法，可确保测试条件一致，减小测量误差，能够大幅度降低抗原检测的假阳性和假阴性结果，提高诊断精准度。但是现有的免疫分析技术大多是单组分分析或者是以单组分串行/并行分析为基础的多指标分析不能完全满足精准测量的要求，将单组分免疫分析发展为多组分免疫分析是精准医学测量发展的必然趋势。单分子数字免疫分析技术（SingleMoleculesDigitalImmunoassay,SMDIA）灵敏度极高，比常规免疫分析技术检测限至少低1000倍，甚至于可以达到单个分子的检测水平，能够满足肿瘤早期检测，血液中稀少抗原检测等高灵敏检测的需求，是近些年免疫分析的前沿技术，被认为是下一代免疫技术。SMDIA与传统免疫分析技术相比，既有相同点又有显著区别。相同点在于，都要将目标抗原与捕获抗体和检测抗体形成夹心结构的免疫复合体。不同部分在于，单分子数字免疫分析技术将免疫复合体离散分装到众多（几万-几百万）的微小空间中，使得绝大部分微空间中的分子个数满足泊松分布，要么含单个目标分子要么不含目标分子（仅有可忽略的部分为两个以上分子），通过识别并计数含有单个分子的微空间个数而对抗原分子定量分析。基于液滴技术的多组分肿瘤标志物分析的单分子数字免疫分析技术尚未发现，本专利技术实现了这一技术。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种单分子多组分数字免疫分析方法，该方法仅可以对多个肿瘤标志物同时检测，检测限在aM-fM之间，满足肿瘤标志物早期筛查的要求。本专利技术采用的技术方案是：一种单分子多组分数字免疫分析方法，包括以下步骤：（1）将不同肿瘤标志物的捕获抗体连接到荧光发射波长不同的微球上，一种荧光微球对应一种肿瘤标志物。磁纳米颗粒上连接检测抗体和半乳糖苷酶。将微球、磁纳米颗粒、待测样品混合反应生成免疫复合物；（2）在微流控芯片上利用磁力将未形成免疫复合物的游离磁纳米颗粒从支路吸引流至废液池；（3）将免疫复合体、荧光微球以及荧光酶底物驱动进入液滴生成系统，分装到液滴中；（4）液滴依次穿过激光焦斑，发出的荧光用于待测样品中抗原分子的定性定量；（5）荧光微球受激发射的荧光波长反映了肿瘤标志物种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。所述的荧光微球是多种发射不同荧光波长的微球，荧光微球中的发光物质可以是有机分子、量子点、荧光蛋白。荧光微球的直径在1-10微米之间。所述磁纳米颗粒具有铁磁性，可以含铁、钴、镍等元素，颗粒直径在20-1000纳米之间。所述微流控芯片含有微通道、缓冲池、存储池等单元，微通道尺寸在10-500微米之间。所述液滴生成系统可以100-100000个/秒频次生成液滴，液滴尺寸在1-60微米之间。本专利技术的有益效果是：本专利技术以多色荧光微球、磁纳米颗粒形成免疫复合物，以液滴分装免疫复合物，激光为激发光源，检测液滴中的荧光。荧光微球受激发射的荧光波长反映了所用抗体的种类，也即反映了抗原种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。该方法可以用于检测血液样品中多个肿瘤标志物的同时高灵敏检测，且检测限在aM到fM的水平。附图说明图1为本专利技术分析方法原理示意图；图2在单分散w/o液滴中包裹荧光微球的实验结果图；图3单分散w/o液滴中包裹β-半乳糖苷酶修饰的磁珠的明场图像。图4单分散w/o液滴中磁珠上修饰的β-半乳糖苷酶与FDG反应的荧光图像。图5液滴中的荧光微球检测图。具体实施方式：下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。如图1、图2、图3和图4所示，为一种单分子多组分数字免疫分析方法，包括以下步骤：（1）将不同肿瘤标志物的捕获抗体连接到荧光发射波长不同的微球上，一种荧光微球对应一种肿瘤标志物。磁纳米颗粒上连接检测抗体和半乳糖苷酶。将微球、磁纳米颗粒、待测样品混合反应生成免疫复合物；（2）在微流控芯片上利用磁力将未形成免疫复合物的游离磁纳米颗粒从支路吸引流至废液池；（3）将免疫复合体、荧光微球以及荧光酶底物驱动进入液滴生成系统，分装到液滴中；（4）液滴依次穿过激光焦斑，发出的荧光用于待测样品中抗原分子的定性定量；（5）荧光微球受激发射的荧光波长反映了肿瘤标志物种类。荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原。微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。实施例1单分散油包水(w/o)液滴中包裹荧光微球a.通道疏水性修饰：用FC40配制含氟三氯硅烷修饰液，修饰液中含氟三氯硅烷的浓度为5%(v/v)。用移液器吸取10μL修饰液注入芯片通道，静置30min后用移液器将通道内溶液吸净，重复上述步骤三次，再将芯片置于80℃烘箱中备用。b.以含有5%(v/v)FS(L)157的FC40溶液作为连续相，以PBST稀释的荧光微球(浓度为1.7*10^6个/mL)作为分散相。将连续相和分散相装入注射器，通过PVC软管与芯片入口相连。c.将注射器放置在恒流注射泵上，打开注射泵提供驱动力，使连续相和分散相流入通道，流速分别为700nL/min和50nL/min。在芯片流动聚焦结构处生成包裹有荧光微球的w/o液滴，液滴流经下游检测区，用共聚焦显微镜拍摄荧光成像图像。（参见图2，左图为明场显微镜照片。右图为同一位置下荧光显微镜照片）。实施例2单分散液滴中磁珠上修饰的β-半乳糖苷酶与荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)(FDG)反应a.通道疏水性修饰方法与上述实施例1中的方法相同。b.磁珠上修饰β-半乳糖苷酶：取50μL磁珠(30m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单分子多组分数字免疫分析方法，其特征在于：/n（1）将不同肿瘤标志物的捕获抗体连接到荧光发射波长不同的微球上，一种荧光微球对应一种肿瘤标志物，磁纳米颗粒上连接检测抗体和半乳糖苷酶；/n将微球、磁纳米颗粒、待测样品混合反应生成免疫复合物；/n（2）在微流控芯片上利用磁力将未形成免疫复合物的游离磁纳米颗粒从支路吸引流至废液池；/n（3）将免疫复合体、荧光微球以及荧光酶底物驱动进入液滴生成系统，分装到液滴中；/n（4）液滴依次穿过激光焦斑，发出的荧光用于待测样品中抗原分子的定性定量；/n（5）荧光微球受激发射的荧光波长反映了肿瘤标志物种类；/n荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原；/n微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。/n

【技术特征摘要】
1.一种单分子多组分数字免疫分析方法，其特征在于：
（1）将不同肿瘤标志物的捕获抗体连接到荧光发射波长不同的微球上，一种荧光微球对应一种肿瘤标志物，磁纳米颗粒上连接检测抗体和半乳糖苷酶；
将微球、磁纳米颗粒、待测样品混合反应生成免疫复合物；
（2）在微流控芯片上利用磁力将未形成免疫复合物的游离磁纳米颗粒从支路吸引流至废液池；
（3）将免疫复合体、荧光微球以及荧光酶底物驱动进入液滴生成系统，分装到液滴中；
（4）液滴依次穿过激光焦斑，发出的荧光用于待测样品中抗原分子的定性定量；
（5）荧光微球受激发射的荧光波长反映了肿瘤标志物种类；
荧光素的荧光表明液滴中是否含有抗原；
微球荧光和荧光素荧光同时出现的概率用于计算抗原浓度。


2.根据权利要求1所述的一种单...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖宏伟，郑维维，陈佳瞿，张清泉，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32