一种细胞涂片的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种细胞涂片的制备方法，其包括细胞悬液配制、细胞固定、细胞染色和细胞干燥的步骤，其中，所述细胞干燥为将所述细胞涂片在50℃、鼓风条件下培养40‑60分钟。本发明专利技术还公开了所述细胞涂片在制备防治疾病的药物中的应用。本发明专利技术的制备方法既能保持或提高细胞回收率、保留完整细胞核型且不影响膜蛋白抗体染色，又能缩减干燥时间、加快整体实验进度。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞涂片的制备方法及其应用
本专利技术属于生物及医学检测领域，具体地涉及一种细胞涂片的制备方法及其应用。
技术介绍
循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells,CTCs)是指在肿瘤生长过程中，从肿瘤原发灶脱落并进入外周血循环系统的实体瘤上皮细胞。CTCs会通过血液循环系统依附到远端组织上生长形成新的肿瘤组织——转移灶。大量临床数据表明，肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的直接原因，因而及早发现CTCs对于癌症的早诊断、术后预判以及疗效评估等具有重要意义。但是CTCs在外周血中的存在数量非常稀少，仅占外周血白细胞的1/106～1/107，并且它的数量在外周血中呈现动态分布，会存在滞后现象，因此对于检测CTCs的要求很高。外周血样本CTCs的检测通常包含富集和鉴定两步。富集时先通过适当离心将含有CTCs的白细胞悬浮液同红细胞分开，为后面进行CTCs的筛选、染色、干燥固定、鉴定做准备。其中，细胞悬浮液干燥、细胞固定的条件通常为烘箱32℃过夜，并且不开鼓风。但是，过久的烘干时间极大地影响了鉴定操作的时长，且细胞的回收率不够理想。《循环肿瘤细胞检测预测肝细胞癌微血管侵犯的临床研究》(第二军医大学硕士学位论文，作者：汪宇，导师：施乐华)公开了一种细胞涂片的制备方法，其操作中先细胞干燥再细胞固定，烘干时间较短，仅15-30分钟，但其细胞回收率仅为52.41％。所以，目前还缺少一种用于CTCs检测的能够保持或提高细胞回收率、不影响细胞核型和膜蛋白抗体染色后的细胞形态，并且操作时间较短的细胞涂片的制作方法。<br>
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏一种既能保持或提高细胞回收率、保留完整细胞核型且不影响膜蛋白抗体染色，又能缩减干燥时间、加快整体实验进度的细胞涂片方法，提供一种细胞涂片的制备方法及其应用。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之一为：提供一种细胞涂片的制备方法，其包括配制细胞悬液、细胞固定、细胞染色和细胞干燥的步骤，其中，所述细胞干燥为将所述细胞涂片在50℃、鼓风条件下培养40-60分钟。在本领域中，以上的细胞干燥过程又称为“烤片”。本领域中的恒温培养箱除了能够控制不同条件的培养温度以外，有一些还具有鼓风功能，因此上述的“鼓风条件”指将此类恒温培养箱鼓风功能开启。理论上所有具有鼓风功能的恒温培养箱都可以用于本专利技术，在本专利技术一较佳的具体实施例中，使用了上海叶拓仪器仪表有限公司的电热恒温干燥箱(型号：101)。在本专利技术技术方案中的其他参数不变的前提下，鼓风功能(包括风速)与本专利技术的电热恒温干燥箱相同或接近相同的电热恒温干燥箱均可以达到本专利技术的效果。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞固定的步骤在所述细胞干燥的步骤之前。现有技术中细胞固定的步骤在所述细胞干燥的步骤之后，其细胞回收率低于本专利技术，仅为52.41％。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述鼓风条件下培养的时间为50分钟以上；例如50分钟。在其他条件相同的情况下，50分钟的烤片时间可带来最佳的细胞回收率(72.99±5.37％)。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞固定使用的固定液为多聚甲醛固定液。本领域常规的细胞固定液理论上均可以用于本专利技术。多聚甲醛是多种组织细胞的良好固定液，对脂类、酶类的保存优于其他固定剂。此外，多聚甲醛的自发荧光非常微弱，不会影响免疫荧光抗体的荧光表达。在本专利技术一更佳的具体实施例中，使用了4％的多聚甲醛溶液，所述％为重量体积百分比。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞悬液的浓度为5×104个/mL。可用本领域常规的各种缓冲液制备细胞悬液。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞悬液为PBS细胞悬液。优选地，所述4％的多聚甲醛固定液和所述PBS细胞悬液的体积百分比为1:1。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞为哺乳动物细胞，优选为人细胞，更优选为人血细胞；最优选地，在配制细胞悬液的步骤之前，还包括将人血细胞与血浆分离的步骤。将人血细胞与血浆分离，有利于细胞的染色和后期的观察与检测。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，所述细胞染色使用CD45抗体染色液和/或DAPI染色液。CD45抗体染色液优选人CD45抗体染色液，CD45是白细胞表面共同抗原，一般白细胞都具有该抗原，人CD45抗体染色液对血细胞尤其是白细胞有特异性染色效果。DAPI染色液即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够和DNA强力结合的荧光素，常用于荧光显微镜观测。DAPI可以透过完整的细胞膜，常用于活细胞和固定细胞的染色。在一较佳的具体实施例中，所述细胞涂片的制备方法中，在加入所述DAPI染色液前，还包括用PBS缓冲液洗涤和用无水乙醇处理的步骤。优选地，所述无水乙醇处理后，还包括吹干的步骤。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案之二为：提供一种细胞涂片在制备防治疾病的药物中的应用。优选地，所述疾病为癌症；更优选地，所述癌症为恶性B细胞淋巴瘤、包括急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)，肝癌，腺癌，肺癌，结肠癌，大肠癌，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，胃癌，胆管癌，非小细胞癌，胆囊癌，食管癌，黑色素瘤，胰腺癌，尿路上皮癌，头颈癌和前列腺癌中的一种或多种。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：大大缩短了干燥时间的同时，还提高了细胞的回收率，样本中富集出的细胞可以被较多地保留在载玻片上，且细胞核型与细胞整体形态保留完整、膜蛋白抗体染色不受影响，极大地提高了实验效率。附图说明图1为不同干燥温度、不同干燥时间条件下的细胞染色图；图2为不同干燥温度、同一干燥时间条件下的细胞染色图；图3为细胞涂片后进行CD45抗体细胞免疫荧光染色的结果，其中A为本专利技术50℃鼓风、干燥60分钟的结果；B为现有技术的方法制作获得的细胞涂片的结果。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。微型台式真空泵：海门市其林贝尔仪器制造有限公司高速离心机：ThermoFisherScientific电热恒温干燥箱(型号：101)：上海叶拓仪器仪表有限公司涡旋混合器：HaimenKylin-BellLabInstruments荧光扫描显微镜：CarlZeiss密度梯度分离液：Ficoll-Pague，GEHealthcare4％多聚甲醛溶液：KingmornC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞涂片的制备方法，其包括细胞悬液配制、细胞固定、细胞染色和细胞干燥的步骤，其特征在于，所述细胞干燥为将所述细胞涂片在50℃、鼓风条件下培养40-60分钟。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞涂片的制备方法，其包括细胞悬液配制、细胞固定、细胞染色和细胞干燥的步骤，其特征在于，所述细胞干燥为将所述细胞涂片在50℃、鼓风条件下培养40-60分钟。


2.如权利要求1中所述的细胞涂片的制备方法，其特征在于，所述细胞固定的步骤在所述细胞干燥的步骤之前。


3.如权利要求1或2中所述的细胞涂片的制备方法，其特征在于，所述鼓风条件下培养的时间为50分钟以上；优选50分钟。


4.如权利要求1-3任一项中所述的细胞涂片的制备方法，其特征在于，所述细胞固定使用的固定液为多聚甲醛固定液；优选4％的多聚甲醛固定液，所述％为重量体积百分比。


5.如权利要求1-4任一项中所述的细胞涂片的制备方法，其特征在于，所述细胞悬液的浓度为5×104个/mL。


6.如权利要求1-5任一项中所述的细胞涂片的制备方法，其特征在于，所述细胞悬液为PBS细胞悬液；优选地，所述4％的多聚甲醛固定液和所述PBS细胞悬液的体积百分比为1:1。


7.如权利要求1-6任一项中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱其军，叶真龙，邵文琪，李新春，张晓霞，
申请(专利权)人：上海细胞治疗集团有限公司，上海白泽医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31