一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法，属于生物安全技术领域。所述的RPA引物如下，RPA上游引物序列Ff‑PRA‑F如SEQ ID No.1所示，其下游引物序列Ff‑PRA‑R如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还提供基于所述RPA引物形成的检测方法。本发明专利技术首次将RPA技术应用到藤仓赤霉菌的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为水稻恶苗病的早期诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测水稻恶苗病藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法
本专利技术属于生物安全
，具体地说，涉及一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法。
技术介绍
由藤仓赤霉菌(Fusariumfujikuroi)引起的水稻恶苗病是水稻上一种系统性侵染病害，发病严重的田块可减产50％以上。另外，藤仓赤霉菌在侵染过程中会产生大量毒素，造成食品安全问题。传统的藤仓赤霉菌的检测方法主要包括有的形态学鉴定和基于PCR技术的分子检测，但由于这些技术需要专业形态学知识，或诊断试剂长，或精密的科学仪器，不适合非专业人员操作，或在基础设施和设备较落后的条件下使用，因此建立藤仓赤霉菌的快速诊断技术有十分重要的意义。重组酶聚合酶等温扩增的技术(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)是一种核酸等温扩增技术。利用RPA进行核酸检测，仅需一对引物，在37℃-42℃的恒温条件下反应10min-15min，即实现目的片段的特异性扩增，且在此过程中，无PCR仪等精密仪器。相比目前应用较多的环等温扩增技术(LAMP)，PRA反应具有仅需一对引物，反应时间短，扩增后产生的单一目的条带可用于测序等诸多有点，具有十分广阔的应用前景，其被称为可替代PCR的核酸检测技术。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在藤仓赤霉菌检测方面的报道。
技术实现思路
1、要解决的问题针对藤仓赤霉菌尚无有效进行RPA技术检测的问题，本专利技术提供一种用于检测藤仓赤霉菌的RPA引物及检测方法，它可以提高藤仓赤霉菌检测的特异性和灵敏度，为水稻恶苗病的早期诊断提供新方法。2、技术方案.为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的RPA引物，所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQIDNo.1所示，所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQIDNo.2所示；一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的检测方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；(3)分析RPA扩增产物。上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(1)中所述的样品为水稻植株样本或待测病原菌培养物。上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，所述的RPA引物的检出下限为10pgDNA/μL。上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：37℃-39℃下反应20min-40min，随后冰上终止反应。上述用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法中，步骤(3)中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物5μL，使用琼脂糖凝胶电泳检测，如果获得高度为262bp的单一条带，说明待测样本中含有藤仓赤霉菌。3、有益效果相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：本专利技术首次将RPA技术应用到藤仓赤霉菌的分子检测，具备特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为水稻恶苗病的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法；其中RPA引物基于藤仓赤霉菌保守基因序列设计，特异性较高、检测准确率高；其中检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在39℃下和30min内完成对藤仓赤霉菌的恒温扩增，无需PCR仪，检测效率远高于常规分子检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象。附图说明图1为实施例1中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的筛选结果图；图2为实施例2中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的特异性检测；图3为实施例3中水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的灵敏度检测。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进一步进行描述。以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购自英国TwistDX公司，商品编号TANFO02KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。其中藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法，包括以下步骤：(1)提取样品中的DNA；具体为将适量菌株接种于PDA培养基上，28℃培养5天，刮下培养基上的菌丝，放入研钵中，加入适量的石英砂，倒入液氮研磨，研磨后的匀浆使用动物基因组DNA快速抽提试剂盒(上海生工)提取DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；步骤(2)中RPA扩增反应的反应条件为：39℃下反应30分钟，随后冰上终止反应；步骤(2)中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：实施例1水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌RPA引物的筛选以藤仓赤霉菌TEF-1基因(GeneBankNo.GQ848524.1)序列为靶标，根据RPA引物的设计原则，设计用于RPA试剂盒(TwistAmpnfo)的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物(即为RPA引物的正向引物和反向引物)序列如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示：正向引物Ff-RPA-F(SEQIDNo.1)：5’-GCTTATCTGTCATCGTGATCCTGACCAAGATC-3’，反向引物Ff-RPA-R(SEQIDNo.2)：5’-TGGACAGGAAAGGGCAAAACGCGCCCATCACTCG-3’：上述引物的RPA扩增产物(由藤仓赤霉菌RPA扩增产物的获取方法获得)进行琼脂糖凝胶的电泳检测，图1中的标号“2”指的是上述引物的检测结果。如图1所示，该引物的RPA扩增产物条带最清晰(262bp位置处的单一条带)且没有杂带。上述扩增产物为单一条带，不像LAMP扩增产物为弥散条带，因此扩增产物可根据条带高度确定结果，且可用于测序。此外，专利技术人在筛选RPA引物的过程中还设计了另外两组引物，它们的序列如下：第一组正向引物Ff-RPA-F2(SEQIDNo.3)：5’-CCCTCGACGATGAGCTTATCTGTCATCGTGATC-3’，反向引物Ff-RPA-R2(SEQIDNo.4)：5’-TAGTTTGACACGTGACAATGCGCTCATTGAGGT-3’；第二组正向引物Ff-RPA-F3(SEQIDNo.5)：5’-AGTGATGGGCGCGTTTTGCCCTTTCCTGTCCA-3’，反向引物Ff-RPA-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的RPA引物，其特征在于：/n所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQ ID No.1所示，/n所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的RPA引物，其特征在于：
所述的RPA引物的上游引物Ff-PRA-F如SEQIDNo.1所示，
所述的RPA引物的下游引物Ff-PRA-R如SEQIDNo.2所示。


2.一种用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
(1)提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的RPA引物，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
(3)分析RPA扩增产物。


3.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗病病原藤仓赤霉菌的检测方法，其特征在于：步骤(1)中所述的样品为水稻植株样本或待测病原菌培养物。


4.根据权利要求2所述的用于检测水稻恶苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：迟元凯，赵伟，戚仁德，叶梦迪，崔晓芳，汪涛，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34