盐单胞菌Halomonas sp ZY-1利用秸秆和地沟油廉价合成生物可降解地膜制造技术

本发明专利技术公开了一种盐单胞菌Halomonas sp.ZY‑1在开放不灭菌条件下，利用秸秆与地沟油合成生物可降解地膜的方法。秸秆经处理得到秸秆上清液，配制秸秆上清液与地沟油体积比为35:1‑40:1的MS培养基。在序批式反应器(SBR)内Halomonas sp.ZY‑1利用不灭菌的秸秆上清液与地沟油MS培养基好氧培养获得菌体，提取胞内聚酯类物质。将聚酯类物质进一步改性获得拉伸强度16‑18MPa的地膜，将地膜深埋20‑30cm耕地土壤中，35d减重率40％‑50％，而置于干燥空气中35d减重率0.3％‑0.5％。以嗜盐菌不灭菌条件下利用废弃物合成生物地膜最大限度降低生产成本，亦为实现绿色生态循环、农业可持续发展提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】
盐单胞菌HalomonasspZY-1利用秸秆和地沟油廉价合成生物可降解地膜
本专利技术涉及盐单胞菌Halomonassp.ZY-1在不灭菌、开放条件下，利用秸秆与地沟油廉价合成生物可降解地膜的方法，属于农用物资领域。
技术介绍
干旱和低温是我国北方农业可持续发展的主要障碍之一，严重影响了东北地区农业经济的发展。地膜的推广大大改善了地方性干旱现象，也改善了现代农业的生产局限。地膜覆盖技术虽然给我国干旱地区农作物的生产带来了很大改善和提升，但也伴随着许多问题，现在广泛使用的地膜主要由石油基材料制成，化学结构稳定，短时间内不能降解。而且会污染土壤，影响农作物种植。目前微生物生产可降解塑料主要利用精致碳源如葡萄糖、鼠李糖、糖蜜等作为发酵底物，而能够以秸秆、地沟油等粗制碳源的较少。在微生物生产可降解塑料时会利用温性菌种，需要高温高压灭菌，而很少利用极端微生物进行可降解塑料的生产。盐单胞菌Halomonassp.ZY-1的优势主要体现在可以在高盐高碱环境(60g/LNaCl,pH10)的条件下利用秸秆上清液和处理过的地沟油为碳源生产可降解塑料PHA。生产PHA的其他菌株中利用的主要是废水、废油、活性污泥，而少见利用秸秆碳源，因此菌种在底物选择和废弃物利用上有较大优势。且生物可降解生物地膜在干燥的空气中35d减重率0.3％-0.5％，深埋20-30cm耕地土壤中，35d减重率40％-50％，并随光照增强，地表温度升高，降解速率也会加快，生物可降解地膜易被分解转化为土壤腐殖质，缓解土壤板结问题。盐单胞菌Halomonassp.ZY-1在高盐高碱(pH9.0-10，NaCl60g/L)特定环境条件下生存，而非嗜盐嗜碱微生物不能在这种特殊环境中存活，因此可有效的避免杂菌污染，节约高压、蒸汽灭菌能源和封闭发酵设备的投资。此外，利用秸秆和地沟油代替精致碳源，降低生产成本的同时节约资源，因此利用嗜盐菌在高盐高碱环境生长可抑制杂菌的特性，降低生产中高能耗灭菌和发酵罐的投资，廉价低能耗的利用秸秆和地沟油合成的生物可降解地膜代替石油基塑料，不仅可以避免白色污染、保护环境，亦加速石化经济向绿色循环经济的转变合成廉价、环保、可降解材料提供技术保障。
技术实现思路
本专利技术针对石化塑料耗费石化能源，以及引发白色污染等系列问题，提出Halomonassp.ZY-1利用秸秆与地沟油在续批式反应器(SBR)内开放条件下合成生物可降解地膜生产方法，进一步优化其材料学性能制成弹性和透光度符合条件的生物可降解地膜。该方法合成生物可降解地膜绿色环保、无污染还能增加土壤肥力，可用做合成地膜。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为:(1)将秸秆用自来水冲洗至无土，50-60℃烘干，经粉碎机粉碎，过100-200目细筛，获得秸秆粉。将50-75g秸秆粉置于1L的2mol/LNaOH溶液中，105-115℃高温处理1-2h，冷却后4000-6000r/min离心10min，收集秸秆上清液。(2)配制MS培养基，其成分为秸秆上清液750-800mL/L、地沟油17-20mL/L、酵母浸提物5-10g/L、Na2HPO4·12H2O10-15g/L、KH2PO41-2g/L、NH4Cl1-2g/L、MgSO40.1-1.5g/L、Fe(III)-NH4-Citrate0.05-0.1g/L、CaCl2·2H2O0.02-0.1g/L、ZnSO4·7H2O0.1-0.5g/L、NaCI60-70g/L，pH调至9.5-11；(3)取1-5％的Halomonassp.ZY-1种子液接于含秸秆上清液和地沟油为碳源的MS培养基的SBR反应器中，搅拌器转速为200-240r/min，25-30℃，溶解氧约爆气12h/周期，每天2周期，连续培养100-140h收集发酵液；(4)将发酵液4000-6000r/min离心10min收集菌体，置于-20℃预冷12-14h，在冻干机内冻干12-24h，依次经蒸馏水洗、离心、丙酮洗、离心、再水洗和离心(4000-6000r/min离心10min，上同)；将菌体放入锥形瓶中，加入氯仿：次氯酸钠3:1(v/v)的混合溶液，混匀后4000-6000r/min离心10min，吸取下层氯仿相平铺于洁净的容器中，加入预冷的95％乙醇10-15ml，析出聚酯类物质。(5)将聚酯类物质60-80份硫、PBAT30-50份、碳酸钙0.5-1份、二氧化钛0.2-0.5份均匀混合。放入高速混合机中以800-1000r/min的转速搅拌15-20min，混合均匀后送入双螺杆挤出、造粒获得的混合物粒子；(6)将获得的混合物粒子在吹膜机组上吹塑成膜，制成生物可降解地膜。本专利技术提供的秸秆与地沟油合成生物可降解地膜的方法优势在于：(1)利用秸秆与地沟油在SBR反应器中开放、不灭菌条件下合成生物可降解地膜，从原来到发酵过程都在降低生物可降解地膜生产成本。(2)该方法合成的生物可降解地膜强拉伸强度为16-18MPa。该方法合成的生物可降解地膜具有良好的生物可降解性，在20-25℃环境下的耕地土壤深埋20-30cm耕地土壤中，35d减重率40％-50％，且生物可降解生物地膜在干燥的空气中35d减重率0.3％-0.5％，可在农业生产应用于地膜生产。本专利技术所用盐单胞菌Halomonassp.ZY-1，样品取自大庆市大同区盐碱土壤经筛选分离得到，Genebank登录号为MH428215，经系统发育分析鉴定上述嗜盐菌与Halomonas.elongata相似度为99％，命名为Halomonassp.ZY-1，见图1。于2018年11月22日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCCNo.16773。附图说明图1为Halomonassp.ZY-1系统发育树图2为生物可降解地膜深埋20-30cm耕地土壤中的减重图3Halomonassp.ZY-1以不同体积地沟油和秸秆培养菌体干重与聚酯类物质差异图4为透射电镜观察Halomonassp.ZY-1胞内积累聚酯类物质(细胞内白色物质是本专利用以合成地膜的原料)图5为Halomonassp.ZY-1利用秸秆与地沟油合成的聚酯类物质图6扫描电镜(SEM)扩大500×和10000×观察合成的聚酯类物质图7为秸秆与地沟油合成聚酯类物质与PHB标准品的红外光谱对比分析(FTIR)图8为不同聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯含量合成地膜拉伸强度图9为聚酯类物质改性前后合成膜对比图10为秸秆与地沟油发酵和改性后合成生物地膜图具体实施方式实施例1、生物可降解地膜的自然降解情况本研究为模拟生物可降解地膜在自然条件下降解的情况，以生物可降解地膜埋藏在土壤中减重率为指标考察其降解能力。(1)取3份制备好的生物可降解地膜样品，每份20-30mg，记为初始质量M0。(2)将生物可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术提出了盐单胞菌Halomonas sp.ZY-1在开放、不灭菌条件下利用秸秆和地沟油合成生物可降解地膜的方法，其特征是，生物可降解地膜的合成步骤如下：/n步骤1：将秸秆粉碎成秸秆粉，经碱液处理得到秸秆上清液，添加地沟油使得秸杆上清液与地沟油体积比为35-40:1，配制MS培养基；/n步骤2：在序批式反应器(SBR)中配置秸秆上清液和地沟油为碳源的MS培养基，不灭菌直接接种盐单胞菌Halomonas sp.ZY-1，在开放不灭菌的SBR内控制发酵条件连续培养100-140h收集菌体细胞；/n步骤3：菌体细胞用氯仿-次氯酸钠法破壁提取胞内聚酯类物质，将聚酯类物质、聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯、碳酸钙、二氧化钛按一定质量比混匀后熔融，挤粒吹塑成改性地膜材质；/n步骤4：经材料学性质分析，地膜具有生物可降解性、韧性、透明度，能够作为合成农用地膜的材料。/n

【技术特征摘要】
1.本发明提出了盐单胞菌Halomonassp.ZY-1在开放、不灭菌条件下利用秸秆和地沟油合成生物可降解地膜的方法，其特征是，生物可降解地膜的合成步骤如下：
步骤1：将秸秆粉碎成秸秆粉，经碱液处理得到秸秆上清液，添加地沟油使得秸杆上清液与地沟油体积比为35-40:1，配制MS培养基；
步骤2：在序批式反应器(SBR)中配置秸秆上清液和地沟油为碳源的MS培养基，不灭菌直接接种盐单胞菌Halomonassp.ZY-1，在开放不灭菌的SBR内控制发酵条件连续培养100-140h收集菌体细胞；
步骤3：菌体细胞用氯仿-次氯酸钠法破壁提取胞内聚酯类物质，将聚酯类物质、聚己二酸/对苯二甲酸丁二酯、碳酸钙、二氧化钛按一定质量比混匀后熔融，挤粒吹塑成改性地膜材质；
步骤4：经材料学性质分析，地膜具有生物可降解性、韧性、透明度，能够作为合成农用地膜的材料。


2.权利要求1所述用于制备生物可降解地膜的盐单胞菌，其特征是，系统发育分析树显示盐单胞菌与Halomonas.elongata相似度为99％，命名为Halomonassp.ZY-1，Genebank登录号为MH428215，于2018年11月22日保存在中国微生物菌种保藏中心(CGMCC)，位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.16773。


3.权利要求1中步骤1所述秸秆上清液，其特征是，秸秆上清液获取方式如下：秸秆经粉碎机粉碎，过100-200目细筛获得秸秆粉，每1L的1-2mol/LNaOH溶液浸泡75-140g秸秆粉，高温高压处理2-4h，4000-6000r/min离心10min收集秸秆上清液，主要成分为纤维素2.5-6％、木糖15-30％、木质素16-25％、酸溶木质素1-5％。


4.权利要求1步骤1中所述地沟油，其特征是，地沟油成分为90-92％油酸、3-4％甘油三酯、2-3％植物油、2-3％动物油。


5.权利要求1步骤2中所述配置秸秆上清液和地沟油为碳源的MS培养基，其特征是，秸秆上清液750-800mL/L、地沟油17-20mL/L、酵母浸提物5-10g/L、Na2HPO4·12H2O10-15g/L、KH2PO41-2g/L、NH4Cl1-2g/L、MgSO40.1-1.5g/L、Fe(III)-NH4-Citrate0.05-0.1g/L、CaCl2·2H2O0.02-0.1g/L、ZnSO4·7H2...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长莉，刘成伟，张杰，赵敏，徐启江，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙;23