一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术公开了一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法，属于生物材料技术领域。制备过程包括预凝胶态胶原的制备、胶原纤维的制备、活化肝素的制备等。其中，预凝胶态胶原能够在4度保持稳定数月，并具有二次凝胶性能，简化了传统胶原凝胶的制备过程。胶原纤维‑肝素是生长因子的载体，使加入凝胶体系中的生长因子缓慢释放。此凝胶系统可以灵活方便的缓释多种生长因子和添加各种细胞，由于预凝胶状态的胶原具有良好的成型性能，并在37℃条件下迅速凝胶，因此凝胶系统除了三维培养的功能外，还可以进一步的应用于原位注射和生物3D打印中。

【技术实现步骤摘要】
一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法
本专利技术涉及生物材料
，具体涉及一种用于3D打印和原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法。
技术介绍
胶原是一种生物相容性良好的生物材料，广泛应用于组织工程和再生医学领域，现已经有一系列产品如胶原修复膜、胶原骨支架等在临床上取得了应用许可。在实验研究中，鼠尾胶原得到了广泛的应用，未变性的胶原溶解于酸性溶液中，中和后在一定盐浓度下在37℃可形成凝胶。但传统的胶原凝胶存在以下不足：1，浓度低，广泛应用的鼠尾胶原的浓度一般为3mg/mL，当提高其浓度后，则难以中和均匀。此类胶原黏度低，不适用3D打印和原位注射。2，凝胶快，3mg/mL鼠尾胶原在中性条件下，即使在4℃下，会在20分钟内完全凝胶，当浓度提高，凝胶速度会加快，不仅每次使用需要现配，且限制了操作时间。目前，将生长因子固定于冻干态胶原的方法已经趋于成熟，如京尼平、碳二亚胺发等。但是，在含细胞的水凝胶中固定生长因子的情况比较复杂，首先，上述的固定方法会破坏活性细胞，故不可取。其次，胶原凝胶方式为其三股螺旋结构逐级组装，传统的固定方法会影响三螺旋结构使胶原失去凝胶性能。近年来，研究者发现细胞和因子在组织再生修复中起到重要的作用，传统的干态胶原，已经不能满足细胞治疗的要求，因此，亟需研发一种适用于临床上的可负载细胞和生长因子的材料体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于3D打印和原位注射的因子缓释中性凝胶系统及其制备方法，其为可打印、可原位注射的半凝胶态胶原，且该胶原可以携带细胞和缓释生长因子。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，该方法包括如下步骤：(1)胶原溶液的制备：以提取的牛跟腱胶原为原材料，将牛跟腱胶原加入0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，制备3-10mg/mL的牛跟腱胶原溶液；(2)胶原纤维制备：在牛跟腱胶原溶液中加入0.1mol/L的PBS溶液和1mol/L氢氧化钠溶液，以酚红为指示剂，将溶液中和至红色，得中性溶液；然后将所得溶液倾倒至5-20倍体积的0.001-0.05mol/L浓度PBS溶液中，于20-37℃水浴条件下磁力搅拌1-4小时，搅拌速度为200-5000转/分钟；所得物料经离心分离后，得到胶原纤维；(3)肝素活化处理：将肝素溶解于0.05mol/L的吗啉乙磺酸中，得到浓度为1-10mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，再加入NHS和EDC后，使溶液中NHS浓度为0.01-0.1mmol/L，EDC浓度为0.02-0.2mmol/L；所得混合物料在4℃条件下反应12h后，反应产物经丙酮沉淀，冻干，即得到活化肝素；(4)胶原纤维与肝素的共价接枝：将步骤(2)制备的胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS或50mmol/L(pH8.2)碳酸氢钠溶液中，再加入活化肝素，活化肝素的加入量为胶原纤维重量的0.01-0.3倍；所得混合物料中胶原纤维含量为1-5wt.％；将所得混合物料在4℃条件下反应12小时后，经0.01mol/L的PBS透析和冻干后，此时肝素共价接枝于胶原纤维表面(肝素上的羧基和胶原纤维表面上的氨基发生共价反应，从而将肝素共价接枝于胶原纤维表面)，得到表面修饰肝素的胶原纤维；(5)预凝胶胶原的制备：取20mL步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液，使用中和剂将其调至红色；所述中和剂为0.1mol/L的PBS、酚红和1mol/L氢氧化钠溶液，或者所述中和剂为10倍浓缩各种培养基和1mol/L氢氧化钠，以溶液呈现红色判定为中性；中和后的溶液在25-37℃水浴条件下处理5-50分钟，然后在4-10℃离心2-5小时，离心力为10000-30000g，可通过离心时间和离心力调节中性胶原浓度；离心后得到的沉淀使用摇晃加搅拌的方式匀质后，即得到具有一定黏度，置于37℃会两次凝胶的可打印、可注射的预凝胶胶原；预凝胶胶原为形成凝胶的成分，置于体内或在37℃条件下，可以得到中性凝胶。(6)将步骤(5)制备的预凝胶胶原、步骤(4)制备的表面修饰肝素的胶原纤维和一定浓度的生长因子混合，经4℃处理12小时后，再加入一定量的细胞，所得混合物料即为所述用于3D打印和或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。其中生长因子的含量为0.1-1000ng/mL。上述步骤(1)中，所述牛跟腱胶原的提取过程如下：将牛跟腱溶解于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中，搅拌72h后，依次进行盐析和乙酸透析过程，透析袋截留分子量为3000-10000Da，得到所述牛跟腱胶原，该过程均为无菌操作。所述含有胃蛋白酶的乙酸溶液的制备过程为：将胃蛋白酶加入浓度为0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，混合均匀后即获得胃蛋白酶的乙酸溶液；该胃蛋白酶的乙酸溶液中胃蛋白酶的含量为1-5mg/mL。上述步骤(1)中，所述盐析过程采用4mol/L的NaCl溶液，所述透析过程采用0.1-0.5mol/L的乙酸。本专利技术设计机理如下：本专利技术公开的凝胶体系，通过酶法提取了无菌的牛跟腱胶原，经过处理后，能够在低温下稳定保持半凝胶状态，其特点为：浓度可控、黏度可控、升温后凝胶迅速，其实质为纤维化的胶原和未纤维化胶原的混合物。使中性胶原的原位注射和生物3D打印成为可能。本专利技术同时合成了一种共价接枝肝素的胶原纤维，肝素对多种生长因子有较强的结合能力，通过共价交联在胶原纤维上的肝素，达到缓释生长因子的目的。本专利技术将胶原预凝胶和胶原纤维-肝素分开制备，胶原凝胶的过程中，胶原分子逐渐形成胶原纤维并相互交错，最终形成了凝胶结构，本专利技术将带有肝素的胶原纤维加入正在发生纤维化过程的胶原中，该纤维会被稳定包裹于凝胶之中，使最终的凝胶体系具有了缓释生长因子的能力。综上，本专利技术得到了一种中性、可负载细胞、可缓释因子的凝胶体系，可用于生物3D打印以及原位注射治疗中。本专利技术的优点有有益效果如下：1、本专利技术所制备的预凝胶态胶原具有一定的成形性能，且在4度能够稳定存在数月，可均匀混合因子和细胞，在37度条件下又能迅速凝胶。这些性质对胶原的生物加工和原位注射都具有重要意义。2、本专利技术所述的凝胶系统具有缓释生长因子、负载细胞的能力，带有细胞和因子的修复材料是组织工程修复材料的发展趋势。3、本专利技术所制备的共价交联有肝素的胶原纤维，独立于胶原预凝胶制备，并于凝胶前添加。胶原纤维-肝素反应时所需的缓冲液、交联剂已通过透析除去，不会污染凝胶主体。附图说明图1为实施例1中MC3T3-e1在高浓度胶原中生长3天。图2为成纤维细胞在凝胶表面生长状态；其中：(a)在添加胶原纤维的含bFGF的凝胶表面生长状态；(b)在添加肝素-胶原纤维的含bFGF的凝胶表面生长状态。图3为本专利技术制备的预凝胶胶原在4℃储存和37℃培养后的状态；其中：(a)4℃储存2个月的预凝胶胶原；(b)放入37℃培养箱20分钟后的胶原凝胶。图4为肝素修饰的胶原纤维光镜形貌。...

【技术保护点】
1.一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：/n(1)胶原溶液的制备：以提取的牛跟腱胶原为原材料，将牛跟腱胶原加入0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，制备3-10mg/mL的牛跟腱胶原溶液；/n(2)胶原纤维制备：/n在牛跟腱胶原溶液中加入0.1mol/L的PBS溶液和1mol/L氢氧化钠溶液，以酚红为指示剂，将溶液中和至红色，得中性溶液；然后将所得溶液倾倒至PBS溶液中，于20-37℃水浴条件下磁力搅拌1-4小时，所得物料经离心分离后，得到胶原纤维；/n(3)肝素活化处理：/n将肝素溶解于吗啉乙磺酸溶液中，得到肝素含量为1-10mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，再加入NHS和EDC；所得混合物料在4℃条件下反应12h后，反应产物经丙酮沉淀，冻干，即得到活化肝素；/n(4)胶原纤维与肝素的共价接枝：/n将步骤(2)制备的胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS或50mmol/L碳酸氢钠溶液中，再加入活化肝素，活化肝素的加入量为胶原纤维重量的0.01-0.3倍，所得混合物料中胶原纤维含量为1-5wt.％；将所得混合物料在4℃条件下反应12小时后，经0.01mol/L的PBS透析和冻干后，此时肝素共价接枝于胶原纤维表面，得到表面修饰肝素的胶原纤维；/n(5)预凝胶胶原的制备：取步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液，使用中和剂将其调至红色；中和后的溶液在25-37℃水浴条件下处理5-50分钟，然后在4-10℃离心2-5小时，离心后得到的沉淀使用摇晃加搅拌的方式匀质后，即得到具有一定黏度、置于37℃会再次凝胶的可打印、可注射的预凝胶胶原；/n(6)将步骤(5)制备的预凝胶胶原、步骤(4)制备的表面修饰肝素的胶原纤维和生长因子混合，经4℃处理12小时后，再加入一定量的细胞，所得混合物料即为所述用于3D打印和或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于3D打印或原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)胶原溶液的制备：以提取的牛跟腱胶原为原材料，将牛跟腱胶原加入0.1-0.5mol/L的乙酸溶液中，制备3-10mg/mL的牛跟腱胶原溶液；
(2)胶原纤维制备：
在牛跟腱胶原溶液中加入0.1mol/L的PBS溶液和1mol/L氢氧化钠溶液，以酚红为指示剂，将溶液中和至红色，得中性溶液；然后将所得溶液倾倒至PBS溶液中，于20-37℃水浴条件下磁力搅拌1-4小时，所得物料经离心分离后，得到胶原纤维；
(3)肝素活化处理：
将肝素溶解于吗啉乙磺酸溶液中，得到肝素含量为1-10mg/mL的肝素的吗啉乙磺酸溶液，再加入NHS和EDC；所得混合物料在4℃条件下反应12h后，反应产物经丙酮沉淀，冻干，即得到活化肝素；
(4)胶原纤维与肝素的共价接枝：
将步骤(2)制备的胶原纤维分散于0.01mol/L的PBS或50mmol/L碳酸氢钠溶液中，再加入活化肝素，活化肝素的加入量为胶原纤维重量的0.01-0.3倍，所得混合物料中胶原纤维含量为1-5wt.％；将所得混合物料在4℃条件下反应12小时后，经0.01mol/L的PBS透析和冻干后，此时肝素共价接枝于胶原纤维表面，得到表面修饰肝素的胶原纤维；
(5)预凝胶胶原的制备：取步骤(1)制备的牛跟腱胶原溶液，使用中和剂将其调至红色；中和后的溶液在25-37℃水浴条件下处理5-50分钟，然后在4-10℃离心2-5小时，离心后得到的沉淀使用摇晃加搅拌的方式匀质后，即得到具有一定黏度、置于37℃会再次凝胶的可打印、可注射的预凝胶胶原；
(6)将步骤(5)制备的预凝胶胶原、步骤(4)制备的表面修饰肝素的胶原纤维和生长因子混合，经4℃处理12小时后，再加入一定量的细胞，所得混合物料即为所述用于3D打印和或原位注射的因子缓释中性凝胶系统。


2.根据权利要求1所述的用于3D打印和原位注射的因子缓释中性凝胶系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述牛跟腱胶原的提取过程如下：
将牛跟腱溶解于含有胃蛋白酶的乙酸溶液中，搅拌72h后，依次进行盐析和乙酸透析过程，透析袋截留分子量为3000-10000...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭凯，郑雄飞，王赫然，朱慧轩，李松，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳自动化研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21