用于检测S.suis 2感染的合成肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测S.suis 2感染的合成肽及其应用。一种用于检测S.suis 2感染的合成肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的合成肽作为包被抗原在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。本发明专利技术提供了一种自行设计的合成肽，通过实验证实，该合成肽能够捕捉到S.suis 2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为包被抗原应用在S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中。本发明专利技术为S.suis 2的快速辅助诊断提供了新思路，可以降低由于S.suis 2感染诊断不及时造成的死亡，具备潜在的良好临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
用于检测S.suis2感染的合成肽及其应用
本专利技术属于医学检测领域，涉及用于检测S.suis2感染的合成肽及其应用。
技术介绍
2型猪链球菌(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)属球菌科、链球菌属(Streptococci)，革兰阳性兼性厌氧菌，是一种重要的人兽共患传染病病原菌。S.suis2不仅能够感染猪导致急性败血症、脑膜炎、心内膜炎和急性死亡，而且可以通过呼吸道和伤口等传播途径，导致人的感染发病和死亡。本病呈全球性分布，对相关从业人员的健康构成严重威胁，已确定为重要的新发传染病病原体。1998年和2005年分别在我国的江苏省和四川省暴发了大规模S.suis2感染疫情，患者中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcaltoxicshocksyndrome,STSS)。患者病程极为凶险，可出现心脏、肝功能损坏、血细胞破坏及造血系统抑制、脑膜炎、听神经损坏等多器官功能受损表现，多在发病1～3日内死亡[1-2]。作为一种新现人兽共患传染病病原，S.suis2流行菌株表现出的高致病性和高病死率特征已经成为全世界关注的公共卫生的焦点[2-4]，而尽早行相应抗感染治疗可大大降低患者死亡率。迄今为止脑脊液和外周血培养仍然是判断人感染S.suis2的金标准，但血培养易受抗凝剂、抗菌药物、标本采集时间及培养方法等多因素影响，阳性率往往较低，所以建立可靠的检测方法对S.suis2感染的对症治疗尤为重要。因此，研究S.suis2的蛋白结构，筛选特异性肽段并建立快速诊断S.suis2感染的方法，对感染早期的应急处置具有重要临床意义。Sao蛋白(Surfaceantigenone)，是Li等在大规模搜寻与S.suis2强致病性相关的功能蛋白的研究过程中发现蛋白[5]。它通过C端LPVTG基序锚定在细胞壁表面，具有高度的保守性[5]。免疫电镜实验证实Sao是一种广泛分布于菌体表面的蛋白，并且Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis2的多种分离株发生特异性反应[5]。表明Sao蛋白是在S.suis2感染过程中表达的有效抗原。可见Sao蛋白具有成为S.suis2感染筛选分子的巨大潜能。实验室前期工作表明，重组Sao蛋白纯化难度大，通过对Sao蛋白一级结构分析，Sao蛋白不稳定系数为42.24，高于阈值40，是不稳定蛋白。在实验过程中遇到了类似易降解问题：蛋白纯化过程中高浓度咪唑洗脱时仍出现蛋白杂带，系重组Sao蛋白降解所致(图1)。因此重组Sao蛋白保存时需加入4种蛋白酶抑制剂PMSF、Pepstantin、Leupeptin和Aprotinin，于4℃仅可稳定一周，-20℃仅可稳定6个月。这些因素阻碍了重组Sao蛋白作为检测标志物的进一步开发。目前已报道的关于Sao蛋白的免疫学信息分析较少，基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物研究未见报道。若能筛选到S.suis2感染特异表达的优势表位，并研制相应的辅助诊断试剂盒，就能实现S.suis2感染的快速辅助诊断，这将大幅度降低由于S.suis2感染诊断不及时造成的死亡。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与S.suis2感染快速辅助诊断相关的基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物。本专利技术的第二个目的是提供上述Sao蛋白免疫优势表位在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供用于S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：利用现有的网络资源和生物信息学工具，结合S.suis2感染与Sao蛋白在菌体表面广泛分布的特点，尤其是Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis2的多种分离株发生特异性反应[5]这一重要理论，初步设计出10个肽段并合成。分别以10个合成肽为包被抗原，以Sao多抗血清(Anti-Sao)为一抗，通过间接ELISA法筛选具有免疫优势的合成肽。我们发现，其中1个合成肽Sao355～384能够与Anti-Sao发生强烈反应，说明Sao355～384在抗S.suis2感染中诱导了免疫优势的抗体应答。目前没有关于此表位的文献报道。课题组进而以Sao355～384为检测抗原，以不同来源血清为一抗，分别是S.suis2感染后人血清为实验组、其他菌(肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等)感染后血清为对照组、正常人阴性血清为阴性对照组，完成间接ELISA检测。数据显示，合成肽Sao355～384仅与S.suis2感染后人血清发生强烈反应，而与其他菌感染后血清、正常人血清不发生反应。结果证实，Sao355～384能够捕捉到S.suis2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为S.suis2感染的检测标志物。在全抗原中，表位是发挥免疫作用的最小单位。为了获得Sao355～384中真正发挥免疫作用的核心表位，本课题将合成肽Sao355～384与载体蛋白偶联，获得了相应抗血清Anti-Sao355～384。进一步，用此抗血清与覆盖Sao355～384全长的截断肽进行结合力检测，从而确定Sao355～384的核心序列。我们发现，表位Sao355～372与Anti-Sao355～384的结合能力最强。目前核心序列Sao355～372也没有相关文献报道。同样，我们以Sao355～372为检测抗原，以不同来源血清为一抗(血清来源同上)完成间接ELISA检测。数据显示，合成肽Sao355～372仅与S.suis2感染后人血清发生强烈反应，而与其他菌感染后血清、正常人血清不发生反应。表明Sao355～372确实是Sao355～384的核心表位，与Sao355～384有相似强度的结合能力，能够捕捉到S.suis2感染后人体外周血中的特异性抗体，可能成为更加理想的检测标志物。因此，本课题不仅发现了Sao蛋白的新表位Sao355～384，而且揭示了其核心表位Sao355～372，并进一步评估了两者作为S.suis2感染检测标志物的能力。一种与S.suis2感染有关的合成肽Sao355～384，该合成肽的氨基酸序列具体如下：SEKQMPSVVNENAVTPEKQMTNKENDNIET(SEQIDNO.1)。该合成肽为包含30个氨基酸的肽段，能够与Anti-Sao、S.suis2感染后人血清发生强烈反应。一种与S.suis2感染有关的合成肽Sao355～372。该合成肽的氨基酸序列具体如下：SEKQMPSVVNENAVTPEK(SEQIDNO.2)。该合成肽为包含18个氨基酸的肽段，能够与Anti-Sao、S.suis2感染后人血清发生强烈反应。合成肽Sao355～384、核心序列Sao355～372作为包被抗原在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。一种S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测人感染S.suis2后血清中的特异性抗体。所述快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有检测标志物Sao355～384。一种S.suis2感染快速辅助诊断本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测S.suis 2感染的合成肽Sao

【技术特征摘要】
1.一种用于检测S.suis2感染的合成肽Sao355～384，其特征在于该合成肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的合成肽Sao355～384在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。


3.一种用于检测S.suis2感染的合成肽Sao355～372，其特征在于该合成肽的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


4.权利要求3所述的合成肽Sao355～384在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。


5.一种S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，潘秀珍，高基民，张会芳，邹萍，李娜，
申请(专利权)人：无锡市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32