与S.suis 2感染检测相关的合成肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了与S.suis 2感染有关的合成肽及其应用。一种与S.suis 2感染有关的合成肽，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的合成肽作为包被抗原在制备S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。本发明专利技术提供了一种自行设计的合成肽，通过实验证实，该合成肽能够捕捉到S.suis 2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为包被抗原应用在S.suis 2感染快速辅助诊断试剂盒中。本发明专利技术为S.suis 2的快速辅助诊断提供了新思路，可以降低由于S.suis 2感染诊断不及时造成的死亡，具备潜在的良好临床应用价值。

【技术实现步骤摘要】
与S.suis2感染检测相关的合成肽及其应用
本专利技术属于医学检测领域，涉及与S.suis2感染有关的合成肽及其应用。
技术介绍
2型猪链球菌(Streptococcussuisserotype2，S.suis2)属球菌科、链球菌属(Streptococci)，革兰阳性兼性厌氧菌，是一种重要的人兽共患传染病病原菌。S.suis2不仅能够感染猪导致急性败血症、脑膜炎、心内膜炎和急性死亡，而且可以通过呼吸道和伤口等传播途径，导致人的感染发病和死亡。本病呈全球性分布，对相关从业人员的健康构成严重威胁，已确定为重要的新发传染病病原体。1998年和2005年分别在我国的江苏省和四川省暴发了大规模S.suis2感染疫情，患者中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(Streptococcaltoxicshocksyndrome,STSS)。患者病程极为凶险，可出现心脏、肝功能损坏、血细胞破坏及造血系统抑制、脑膜炎、听神经损坏等多器官功能受损表现，多在发病1～3日内死亡[1-2]。作为一种新现人兽共患传染病病原，S.suis2流行菌株表现出的高致病性和高病死率特征已经成为全世界关注的公共卫生的焦点[2-4]，而尽早行相应抗感染治疗可大大降低患者死亡率。迄今为止脑脊液和外周血培养仍然是判断人感染S.suis2的金标准，但血培养易受抗凝剂、抗菌药物、标本采集时间及培养方法等多因素影响，阳性率往往较低，所以建立可靠的检测方法对S.suis2感染的对症治疗尤为重要。因此，研究S.suis2的蛋白结构，筛选特异性肽段并建立快速诊断S.suis2感染的方法，对感染早期的应急处置具有重要临床意义。Sao蛋白(Surfaceantigenone)，是Li等在大规模搜寻与S.suis2强致病性相关的功能蛋白的研究过程中发现蛋白[5]。它通过C端LPVTG基序锚定在细胞壁表面，具有高度的保守性[5]。免疫电镜实验证实Sao是一种广泛分布于菌体表面的蛋白，并且Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis2的多种分离株发生特异性反应[5]。表明Sao蛋白是在S.suis2感染过程中表达的有效抗原。可见Sao蛋白具有成为S.suis2感染筛选分子的巨大潜能。实验室前期工作表明，重组Sao蛋白纯化难度大，通过对Sao蛋白一级结构分析，Sao蛋白不稳定系数为42.24，高于阈值40，是不稳定蛋白。在实验过程中遇到了类似易降解问题：蛋白纯化过程中高浓度咪唑洗脱时仍出现蛋白杂带，系重组Sao蛋白降解所致(图1)。因此重组Sao蛋白保存时需加入4种蛋白酶抑制剂PMSF、Pepstantin、Leupeptin和Aprotinin，于4℃可稳定一周，-20℃可稳定6个月。这些因素阻碍了重组Sao蛋白作为检测标志物的进一步开发。目前已报道的关于Sao蛋白的免疫学信息分析较少，基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物研究未见报道。若能筛选到S.suis2感染特异表达的优势表位，并研制相应的辅助诊断试剂盒，就能实现S.suis2感染的快速辅助诊断，这将大幅度降低由于S.suis2感染诊断不及时造成的死亡。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是针对上述技术问题，提出一种与S.suis2感染快速辅助诊断相关的基于Sao蛋白免疫优势表位的检测标志物。本专利技术的第二个目的是提供上述Sao蛋白免疫优势表位在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术的第三个目的是提供用于S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术方案实现的：利用现有的网络资源和生物信息学工具，结合S.suis2感染与Sao蛋白在菌体表面广泛分布的特点，尤其是Sao蛋白特异性抗体可以和S.suis2的多种分离株发生特异性反应[5]这一重要理论，初步设计出10个肽段并合成。分别以10个合成肽为包被抗原，以Sao多抗血清(Anti-Sao)为一抗，通过间接ELISA法筛选具有免疫优势的合成肽。我们发现，合成肽Sao149～164能够与Sao多抗血清发生强烈反应，说明Sao149～164在抗S.suis2感染中诱导了免疫优势的抗体应答。目前没有关于此表位的文献报道。课题组进而以Sao149～164为检测抗原，以不同来源血清为一抗，分别是S.suis2感染后人血清为实验组、其他菌(肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌等)感染后血清为对照组、正常人阴性血清为阴性对照组，完成间接ELISA检测。数据显示，合成肽Sao149～164仅与S.suis2感染后人血清发生强烈反应，而与其他菌感染后血清、正常人血清不发生反应。结果证实，Sao149～164能够捕捉到S.suis2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为S.suis2感染的检测标志物。一种与S.suis2感染有关的合成肽Sao149～164，该合成肽的氨基酸序列具体如下：IEFIDNDNVFNNFYTP(SEQIDNO.1)。该合成肽为包含16个氨基酸的肽段，能够与Anti-Sao、S.suis2感染后人血清发生强烈反应。合成肽Sao149～164作为包被抗原在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。一种S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测人感染S.suis2后血清中的特异性抗体。所述快速辅助诊断试剂盒，该试剂盒含有检测标志物Sao149～164。所述快速辅助诊断试剂盒还包括ELISA检测常用的试剂。如包被液、牛血清白蛋白V、PBS缓冲液、HRP-羊抗鼠多克隆血清、终止液、TMB显色液等，还可以含有阴、阳性对照品。有益效果：本专利技术提供了一种自行设计的合成肽，高效液相色谱法分析该合成肽纯度可高达93.22％。合成肽为白色粉末状冻干粉，性质稳定，-20℃条件下可保存数年。通过实验证实，该合成肽能够捕捉到S.suis2感染后人体外周血中的特异性抗体，可以作为包被抗原应用在S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中。本专利技术为S.suis2的快速辅助诊断提供了新思路，可以降低由于S.suis2感染诊断不及时造成的死亡，具备潜在的良好临床应用价值。附图说明图1Sao蛋白Ni-IDA亲和层析纯化检测1：诱导的上清；2：流出液；3：30mM咪唑漂洗液；4：60mM咪唑漂洗液；5:90mM咪唑漂洗液；6～9：250mM咪唑洗脱液；箭头：重组Sao蛋白降解所致杂蛋白带。图2间接ELISA法筛选Sao的免疫优势B细胞表位肽图3Sao149～164与不同来源人血清的结合情况1～24为正常人阴性血清；25为表皮葡萄球菌感染后人血清；26为屎肠球菌感染后人血清；27为肺炎克雷伯菌感染后人血清；28为大肠埃希菌感染后人血清；29～31为猪链球菌感染后不同人的血清。具体实施方式实施例1：05ZYH33来源的Sao序列信息及线性B细胞表位预测1.1明确Sao蛋白序列：Sao蛋白全长580个氨基酸，其中，1-29位氨基酸为信号肽，具体序列如SEQIDNO.2所示。...

【技术保护点】
1.一种与S.suis 2感染有关的合成肽Sao

【技术特征摘要】
1.一种与S.suis2感染有关的合成肽Sao149～164，其特征在于该合成肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。


2.权利要求1所述的合成肽Sao149～164在制备S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒中应用。


3.一种S.suis2感染快速辅助诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒含有权利要求1所述的合成肽Sao149～164。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晶，张婷，苏兆亮，董蕊锐，陈月娟，王瑶，
申请(专利权)人：无锡市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏;32