一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法技术

本发明专利技术提供一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β‑actin表达水平的引物组和探针，还包括标准对照品和阴性对照品。本发明专利技术还提供了一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒的使用方法。本发明专利技术通过设计扩增TYMS的特异性引物和探针，利用人工构建基因标准品模拟群体样本的中位值作为对照进行检测，并使用热启动酶保证检测结果的准确性和体系的稳定性。

A human gene expression assay using TYMS

【技术实现步骤摘要】
一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法
本专利技术应用于基因检测
，具体涉及一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法。
技术介绍
氟类药物包括5-FU、替加氟、卡莫氟、氟尿苷、脱氧氟尿苷以及卡培他滨等,对消化道肿瘤及其他实体瘤均有良好疗效，在肿瘤内科治疗中占有重要地位。当氟类药物进入人体后，可被转化为活性代谢产物一磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUMP)、三磷酸氟尿嘧啶脱氧核苷(FdUTP)和三磷酸氟尿嘧啶(FUTP)等嘧啶类核苷酸类似物，进而产生抗肿瘤活性。TYMS(ThymidylateSynthetase，TS)基因编码的胸苷酸合成酶，是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子，也是氟类药物发挥细胞毒作用的目标酶。氟类药物转化为FdUMP后，与TS、5,10-亚甲基四氢叶酸结合形成三联复合物，dUMP与TS结合后转化为脱氧胸腺嘧啶核苷dTMP，使DNA合成受限。多种肿瘤的临床研究均显示TYMSmRNA表达水平与氟类药物疗效密切相关，例如：结直肠癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌等。临床研究表明，低TYMSmRNA水平的肿瘤患者接受氟类药物化疗的效果较好，中位生存期较长。反之，TYMS高表达的患者接受氟类治疗疗效较差。目前，在临床肿瘤标志物检测方法中，主要应用免疫组化法(化学染色)、流式细胞技术、免疫放射法等传统技术，但存在实验过程过于繁琐，结果读取主观影响较大等缺点。近年来，荧光定量PCR凭借检测时间短、检测敏感性高及能进行实时检测，反应基因在组织中的初始含量，检测时间短，还避免了遗留污染的发生等优点逐渐在临床上部分取代传统检验方法。荧光定量PCR常见方法有SYBRGreenI染料法和TaqMan探针法。其中，SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如TaqMan法，且必须通过观察溶解曲线来判断其特异性。现有文献和报道中常用的检测TYMS基因表达量检测方法，是在采用荧光定量PCR的基础上，人工合成标准品，然后通过相对定量的方法来判定TYMSmRNA拷贝数。通过人工合成标准品作为对照，只能检测样本中TYMSmRNA拷贝数，并不能比较该样本TYMSmRNA在大规模统计样本中TYMSmRNA水平高低。临床上主要是基于统计样本中中位值来判断待检样本TYMS表达水平的高低，因此采用单独检测TYMSmRNA拷贝数对于临床用药指导意义有限，临床还是需要大规模统计样本才可以判定某一样本中TYMSmRNA表达水平的高低。如果每次检测都要进行大规模统计样本分析用于临床用药指导，整个检测过程复杂，并且成本高。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的上述问题，提供一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法。本专利技术基于荧光定量RT-PCR和多重PCR，通过设计扩增TYMS的特异性引物和探针，利用人工构建基因标准品模拟群体样本的中位值作为对照进行检测，并使用热启动酶保证检测结果的准确性和体系的稳定性。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β-actin表达水平的引物组和探针：TYMS-F上游引物：TGACTTTATACACACTTTGGGAGA，TYMS-R下游引物：CCTTCAATCTGAAAGTCTTCA，TYMS-P探针：FAM-CTTCGAAAAGTTGAGAAAATTGATG-TRAMA；β-actin-F上游引物：ACCATGTACCCGGGCATT，β-actin-R下游引物：TCTGCTGGAAGGTGGACAGTG，β-actin-P探针：VIC-CATCGCACCCCCAGAGCGCAAGT–TRAMA。进一步的，一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒还包括标准对照品和阴性对照品。进一步的，所述阴性对照品为DEPC处理的去离子水。进一步的，所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX；3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1。进一步的，用于检测TYMS基因表达水平的探针5’端荧光报告基团选用FAM，3’端的荧光淬灭基团选用TAMRA；用于检测内参基因β-actin表达水平的探针5’端荧光报告基团选用VIC，3’端的荧光淬灭基团选用TAMRA。一种基于上述人类TYMS基因表达水平检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：1)收集待检患者的外周血，提取总RNA，将所得的总RNA逆转录为cDNA备用；2)以所述cDNA、标准对照品和阴性对照品为模板分别配置PCR反应体系，混匀后进行荧光定量PCR，同时收集FAM和VIC信号，执行实时PCR；3)记录所述PCR反应体系中FAM和VIC通道的Ct值，并对结果进行基因分型判读。进一步的，所述荧光定量PCR的条件为：第一阶段：95℃2分钟，1个循环；第二阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，5个循环；第三阶段：95℃30秒，60℃30秒，72℃30秒，40个循环；信号收集：第三阶段60℃时收集FAM和VIC信号，执行实时PCR。进一步的，所述PCR反应体系包括5×colorlessGoqFlexiBuffer、Mgcl2溶液、PCR核糖核酸(PCRnuclextide)、热启动聚合酶(Hotstartpolymerase)、TYMS基因上游引物、TYMS基因下游引物、TYMS基因探针、β-actin基因上游引物、β-actin基因下游引物、β-actin基因探针、模板(Template)、DDH2O。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：(1)以患者TYMS基因及β-actin基因表达量的中位值为标准参考，利用人工构建TYMS基因和β-actin基因标准品模拟中位值，并制备标准对照品，标准对照品可以长期保存；通过标准对照品判定TYMS基因表达量水平高低，不需要再做大规模样本统计确定临床中位值，操作简单，节约时间和成本；(2)本专利技术采用多重荧光定量PCR，一个反应管同时检测TYMS和β-actin基因相对表达量，操作简单，检测周期短，成本低；(3)本专利技术采用热启动Taq酶一步法反应体系，体系稳定，结果准确。附图说明图1为本专利技术一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法的阴性对照品反应管扩增曲线。图2为本专利技术一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法的标准对照品反应管扩增曲线。图3为本专利技术一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒及使用方法的1-10号待测样品反应管内扩增曲线。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本专利技术技术方案作进一步详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β-actin表达水平的引物组和探针：/nTYMS-F上游引物：TGACTTTATACACACTTTGGGAGA，/nTYMS-R下游引物：CCTTCAATCTGAAAGTCTTCA，/nTYMS-P探针：FAM-CTTCGAAAAGTTGAGAAAATTGATG-TRAMA；/nβ-actin-F上游引物：ACCATGTACCCGGGCATT，/nβ-actin-R下游引物：TCTGCTGGAAGGTGGACAGTG，/nβ-actin-P探针：VIC-CATCGCACCCCCAGAGCGCAAGT–TRAMA。/n

【技术特征摘要】
1.一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：包括用于检测TYMS基因表达水平的引物组和探针、用于检测内参基因β-actin表达水平的引物组和探针：
TYMS-F上游引物：TGACTTTATACACACTTTGGGAGA，
TYMS-R下游引物：CCTTCAATCTGAAAGTCTTCA，
TYMS-P探针：FAM-CTTCGAAAAGTTGAGAAAATTGATG-TRAMA；
β-actin-F上游引物：ACCATGTACCCGGGCATT，
β-actin-R下游引物：TCTGCTGGAAGGTGGACAGTG，
β-actin-P探针：VIC-CATCGCACCCCCAGAGCGCAAGT–TRAMA。


2.如权利要求1所述一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：还包括标准对照品和阴性对照品。


3.如权利要求2所述一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照品为DEPC处理的去离子水。


4.如权利要求1所述一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：所述探针5’端荧光基团为适用于荧光定量PCR分析的常规使用的荧光报告基团，所述荧光报告基团为FAM、VIC、HEX、cy5或者ROX；3’端的淬灭基团为适用于荧光定量PCR的常规使用的荧光淬灭基团，所述荧光淬灭基团为TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB或者Dabcy1。


5.如权利要求4所述一种人类TYMS基因表达水平检测试剂盒，其特征在于：用于检测TYMS基因表达水平的探针5’端荧光报告基团选用FAM，3’...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙松松，韩勋领，罗锋，
申请(专利权)人：重庆浦洛通基因医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50