一种由毕赤酵母表达串联蛋白的纯化工艺制造技术

本发明专利技术涉及一种由毕赤酵母表达串联蛋白的纯化工艺。具体地，本发明专利技术提供一种重组人胰岛素原C肽串联蛋白的纯化方法，包括步骤：(1)对发酵液进行离心，得到发酵离心上清液；(2)加入电解质进行盐析，得到沉淀蛋白；(3)加入复溶剂，得到沉淀蛋白复溶液；(4)沉淀蛋白复溶液经第一柱层析纯化；(5)加入胰蛋白酶和羧肽酶B进行双酶切，得到酶切液；(6)对所述的酶切液依次进行反相超滤和正相超滤，得到超滤液；(7)所述的超滤液经第二柱层析纯化；(8)进行正相超滤，得到重组人胰岛素原C肽原液。本发明专利技术所述方法能够制备高纯度和高收率的重组人胰岛素原C肽。

Purification of tandem protein expressed by Pichia pastoris

【技术实现步骤摘要】
一种由毕赤酵母表达串联蛋白的纯化工艺
本专利技术涉及生物制药领域，具体地，本专利技术涉及一种由毕赤酵母表达串联蛋白的纯化工艺。
技术介绍
90年代以来胰岛素原C肽(简称C肽)得到了日益广泛的关注。C肽是胰岛β细胞分泌的由31个氨基酸组成的多肽。以瑞典科学家Johansson和Waren[1-2]教授为首的研究小组发现C肽具有改善糖尿病远期并发症(包括糖尿病肾病)的作用。胰岛素原C肽的获得主要有化学合成及基因工程方法等。化学合成因为成本高、产率低、生产周期长以及产生环境污染等已逐渐被基因工程方法代替。目前最被看好的方法是用基因工程方法直接表达胰岛素原C肽。用大肠杆菌表达胰岛素原C肽的方法已有报道，其方法是先用串联方法获得多拷贝的C肽融合蛋白，再进行酶切、纯化。但是表达水平较低，方法复杂，而且大肠杆菌须用大量酪蛋白水解物、Tryptone、YeastExtract等，在诱导中要用到价格昂贵的诱导剂如IPTG等，成本非常高。利用毕赤酵母表达C肽融合蛋白，能够实现高密度表达；同时由于毕赤酵母所用的原料都是盐类，诱导剂是甲醇，都很便宜，也本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人胰岛素原C肽串联蛋白的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：/n(1)对含有重组人胰岛素原C肽串联蛋白的发酵液进行离心，得到发酵离心上清液；/n(2)向发酵离心上清液中加入电解质进行盐析，得到沉淀蛋白；/n(3)向沉淀蛋白中加入复溶剂，离心，去除沉淀，得到沉淀蛋白复溶液；/n(4)沉淀蛋白复溶液经第一柱层析纯化，收集含有第一样品峰的第一洗脱液，其中，所述第一柱层析使用的第一层析柱的的第一填料包括疏水改性琼脂糖凝胶；/n(5)向含有第一样品峰的第一洗脱液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B进行双酶切，得到酶切液；/n(6)对所述的酶切液依次进行反相超滤和正相超滤，得到超滤液；/n(7)所述...

【技术特征摘要】
1.一种重组人胰岛素原C肽串联蛋白的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(1)对含有重组人胰岛素原C肽串联蛋白的发酵液进行离心，得到发酵离心上清液；
(2)向发酵离心上清液中加入电解质进行盐析，得到沉淀蛋白；
(3)向沉淀蛋白中加入复溶剂，离心，去除沉淀，得到沉淀蛋白复溶液；
(4)沉淀蛋白复溶液经第一柱层析纯化，收集含有第一样品峰的第一洗脱液，其中，所述第一柱层析使用的第一层析柱的的第一填料包括疏水改性琼脂糖凝胶；
(5)向含有第一样品峰的第一洗脱液中加入胰蛋白酶和羧肽酶B进行双酶切，得到酶切液；
(6)对所述的酶切液依次进行反相超滤和正相超滤，得到超滤液；
(7)所述的超滤液经第二柱层析纯化，收集含有第二样品峰的第二洗脱液，所述第二柱层析使用的第二层析柱的的第二填料包括琼脂糖凝胶；
(8)对含有第二样品峰的第二洗脱液进行正相超滤，得到重组人胰岛素原C肽原液。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述的沉淀蛋白与所述复溶剂的比为1：15-30(w/v)，较佳地1：15-25(w/v)，更佳地1：18-22(w/v)。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤(5)中，胰蛋白酶与底物的含量比为1：500-700，较佳地1：550-650；和/或
在所述步骤(5)中，，羧肽酶B与底物的含量比为1：1300-1700，较佳地1：1400-1600，最佳地14...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾伟平，李校堃，程萍，倪晶，
申请(专利权)人：上海新生源医药集团有限公司，浙江浙新医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31