一种从红枸杞中制备PD-1/PD-L1抑制剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种从天然植物红枸杞中提取活性成分及其提取方法，更具体涉及红枸杞中提取的活性成分可有效阻断PD1‑PDL1结合，从而消除、抑制、降低或阻断PD1‑PDL1相互作用及其后续作用，该活性成分以及可药用载体的药物组合物可以有效成为PD1‑PDL1新型抑制剂，使其在抗肿瘤相关疾病上应用，可以为临床治疗方案提供参考。

A method for preparing PD-1 / PD-L1 inhibitors from Lycium barbarum

【技术实现步骤摘要】
一种从红枸杞中制备PD-1/PD-L1抑制剂的方法
：本专利技术涉及天然产物的应用
，从天然植物红枸杞中提取活性成分，更具体涉及从红枸杞中提取具有消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1结合的活性成分以及该活性成分可药用载体的药物组合物，以及在相关疾病上应用。
技术介绍
：人体的免疫系统可识别肿瘤细胞、调控肿瘤生长，甚至清除肿瘤，在此过程中T细胞起核心作用。T细胞的活化先需要由抗原提呈细胞提供的第一信号刺激，同时还需要协同刺激分子提供的第二信号刺激。协同刺激分子不但提供增强免疫的共刺激信号，而且还提供抑制免疫的共抑制信号，以此达到调节免疫的作用，这些免疫抑制信号即为免疫检查点。在正常机体中，免疫检查点一方面维持对自身抗原的免疫耐受，避免过强的免疫反应造成自身免疫疾病，另一方面负反馈免疫反应，避免过度刺激造成的组织损伤。然而，肿瘤细胞可异常上调共抑制分子及其相关配体，例如PD-1、PD-L1，抑制T细胞的免疫活性，造成肿瘤免疫逃逸。目前已知的免疫检查点包括：PD-1/PD-L1、CTLA-4/CD80/CD86和TCR，LAG3,TIGIT,TIM-3,BTLA。目前位于免疫疗法尖端的“免疫检查点阻断剂”对于很多癌症，尤其是恶性且化学药物耐受性癌症的治疗中有着明显的效果。其中，阻断PD-1/PD-L1通路是迄今为止最成功的癌症免疫治疗策略。PD-1及其配体PD-L1是近年研究比较透彻的免疫检查点分子，它们在肿瘤微环境中发挥重要的负性调控作用。PD-1与PD-L1结合后会通过mTOR以及PI3K/AKT通路对T细胞产生明显的抑制效应。PD-1是在T细胞进入肿瘤微环境后，在该活化过程的后期减弱T细胞的应答。由于适应性免疫抵抗抑制了肿瘤微环境中T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，阻断PD-1/PD-L1相互作用可以恢复机体对肿瘤的免疫应答。PD-1和其配体PD-L1相结合可以有效降低免疫T细胞参与的免疫应答。肿瘤细胞通过高表达PD-L1逃逸机体内免疫监督，阻断PD1与PD-L1的相互作用可以显著提高CD8+细胞毒T细胞的活性，以杀伤肿瘤细胞。PD-L1主要表达于T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、间充质干细胞和骨髓来源的肥大细胞。PD-L1也表达于非骨髓来源的细胞，如血管内皮细胞、上皮细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞、胰岛细胞，脑部星状细胞和各类非淋巴系肿瘤如黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾细胞癌，亦表达于免疫特赦部位的细胞，如胎盘、眼睛。这表明PD-L1在调节自身反应性T、B细胞和免疫耐受方面具有一定广泛性，并且在外周组织T和B细胞应答起作用。PD-1和PD-L1相互作用以调节控制T细胞的活化在肿瘤和病毒感染中得到了大量验证。PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面，这些肿瘤细胞包括：肺癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，膀胱癌，结肠癌，乳腺癌，神经胶质瘤，肾癌，胃癌，食道癌，口腔鳞状细胞癌，头颈癌。自2014年，首个PD-1单抗Pembrolizumab上市以来，到目前为止，已经批准了一共15款PD-1/PD-L1抗体药物，其中单抗药物9款，小分子肽类抑制剂和非小分子肽类药物各3款，PD-1/PD-L1药物已经成为肿瘤免疫领域的重要组成部分。据2018年统计，从2017年9月至2018年9月，PD-1/PD-L1药物临床试验有748项临床试验最新开展，活跃状态的临床试验共计有2250项。在这2250项临床试验中，1716项临床试验的治疗方案为PD-1/PD-L1抗体药物与其他癌症疗法相联合。PD-1/PD-L1药物临床试验的数量显著增长，已经从2006年的区区一项，增长至2018年目前的2250项。目前，针对PD-1/PD-L1抗体药物不同癌症患者中显示出持久的抗肿瘤反应。然而，抗体治疗的固有缺点，如成本高，口服差，免疫相关的副作用，以及单药的一线总人群有效率仅有20％-30％。因此，开发PD-1/PD-L1通路的非肽类小分子抑制剂是治疗肿瘤患者的一种很有前景的选择。枸杞，又称枸杞子、红耳坠，是茄科小灌木枸杞的成熟子实。枸杞子药食同源的历史悠久，是驰名中外的名贵中药材，早在《神农本草经》中就被列为上品，称其为"久服轻身不老、耐寒暑"；有延衰抗老的功效，又名"却老子"。枸杞子中含有多种氨基酸，并含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等特殊营养成分，使其具有非常好的保健功效。枸杞是对人体健康有着重要的意义，可以对身体进行保健，是人们所喜爱的果实，宁夏枸杞的品质领先于全国各地，成为枸杞的代表，被誉为枸杞之乡。红枸杞功效也多种作用：(1)免疫调节；(2)抗衰老:免疫衰老与细胞凋亡密切相关；(3)抗肿瘤:枸杞多糖不仅是一种调节免疫反应的生物反应调节剂，而且可通过神经--内分泌--免疫调节网络发挥抗癌作用。(4)抗疲劳；(5)抗辐射损伤；(6)调节血脂；(7)降血糖；(8)降血压；(9)保护生殖系统；(10)提高视力；(11)提高呼吸道抗病能力；(12)美容养颜，滋润肌肤；(13)保护肝脏；(14)增强造血功能；此外.宁夏枸杞还具有调节神经内分泌、修复缺血性脑损伤、减轻脑水肿、改善大脑功能等作用。
技术实现思路
本专利技术公开了一种从天然植物红枸杞中提取活性成分及其提取方法，更具体涉及红枸杞中提取的活性成分可有效阻断PD1-PDL1结合，从而消除、抑制、降低或阻断PD1-PDL1相互作用及其后续作用，该活性成分以及可药用载体的药物组合物可以有效成为PD1-PDL1新型抑制剂，使其在抗肿瘤相关疾病上应用。为了实现上述目的，本专利技术解决技术问题采用以下的技术方案：红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于，活性成分来自红枸杞水相提取物部位和乙酸乙酯萃取部位；更进一步，红枸杞水相提取物部位用D101大孔吸附树脂分离，以不同比例乙醇-水体系洗脱，活性成分主要来自纯水、20％、40％、60％、95％洗脱部位、以及乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离且以不同比例氯仿-甲醇体系进行洗脱的纯氯仿、50:1、10:1、5:1、甲醇洗脱部位。简言之，红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分来自于水相提取物的纯水、20％、40％、60％、95％洗脱部位和乙酸乙酯萃取部位的纯氯仿、50:1、10:1、5:1、甲醇洗脱部位。红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分的制备方法如下：(1)提取：选取优质的红枸杞，纯水清洗晾干，先用60-80％乙醇浸泡4-24h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入60-80％乙醇超声提取2次，每次提取1-5h，减压浓缩得60-80％乙醇浸膏；用85-98％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85-98％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏。乙醇总浸膏按照1:1-5的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.5-1:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于，活性成分来自红枸杞水相提取物部位和乙酸乙酯萃取部位。/n

【技术特征摘要】
1.红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于，活性成分来自红枸杞水相提取物部位和乙酸乙酯萃取部位。


2.根据权利要求1所述红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于：红枸杞水相提取物部位用D101大孔吸附树脂分离，以不同比例乙醇-水体系洗脱，活性成分主要来自纯水、20％、40％、60％、95％洗脱部位,以及乙酸乙酯部位经硅胶柱层析分离且以不同比例氯仿-甲醇体系进行洗脱的纯氯仿、50:1、10:1、5:1、甲醇洗脱部位。


3.根据权利要求1所述红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分，其特征在于：红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分的制备方法如下：
(1)提取：选取优质的红枸杞，纯水清洗晾干，先用60-80％乙醇浸泡4-24h，提取两次过滤得滤液，减压回收溶剂，滤渣加入60-80％乙醇超声提取2次，每次提取1-5h，减压浓缩得60-80％乙醇浸膏；用85-98％乙醇同法操作提取一次，减压浓缩得85-98％乙醇浸膏，合并得乙醇总浸膏；乙醇总浸膏按照1:1-5的水完全溶解，再用乙酸乙酯萃取，水与乙酸乙酯比例为0.5-1:1，萃取后得乙酸乙酯部位和水相提取物部位；
(2)分离：取一定量的乙酸乙酯部位，用硅胶柱层析进行分离，以不同比例氯仿-甲醇体系(纯氯仿、50:1、25:1、10:1、5:1、甲醇)进行洗脱，得6个洗脱部位；水相提取物部位用D101大孔吸附树脂，以不同比例乙醇-水体系(纯水、20％、40％、60％、80％、95％)洗脱，得6个洗脱部位。


4.根据权利要求1-3任一所述红枸杞有效阻断PD1-PDL1结合的活性成分药物，其特征在于：包含红枸杞活性成分以及可药用载体的药物组合物。

【专利技术属性】
技术研发人员：林鹏程，吴疆，张金魁，王敏，王泽，王怡，吴蕾，
申请(专利权)人：青海民族大学，
类型：发明
国别省市：青海;63