一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9及其编码基因与应用。一株海洋弧菌Vibrio pomeroyi strain 12613，该菌株2020年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO:2020050。一种胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；上述编码基因表达的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术中的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9对胶原蛋白有显著的膨胀功能，但对胶原蛋白无降解活性，在皮革加工业以及其它领域胶原蛋白的膨胀处理中有很大的应用潜力。

A marine collagen expansive protease VP9 and its coding gene and Application

【技术实现步骤摘要】
一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9及其编码基因与应用
本专利技术涉及一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9及其编码基因与应用，属于生物技术

技术介绍
海洋覆盖了地球表面约71％的面积，蕴藏着数量巨大、种类繁多的海洋微生物。为了适应海洋环境(即低温、高盐、高压)，海洋细菌进化出多种生理机制，产生大量具有独特性质和作用的酶类。因此，海洋微生物成为开发新型工业、医学用酶的巨大宝库。从海洋微生物中筛选分离具有特殊作用机制和独特功能的蛋白酶成为研究的热点之一。发现海洋微生物中新的蛋白酶并研究其功能，对开发和利用海洋微生物蛋白酶资源具有重要意义。胶原蛋白是所有高等生物中含量最丰富的纤维状蛋白质，广泛存在于动物的骨、腱、软骨和皮肤中，是哺乳动物细胞外基质(mammalianextracellularmatrix，ECM)的主要成分。哺乳动物细胞外基质是由很多大分子构成的错综复杂的网络，其中除了胶原蛋白，还存在很多非胶原糖蛋白、蛋白聚糖和弹性蛋白等。这些糖蛋白及蛋白聚糖与胶原蛋白产生各种相互作用，共同维持着胶原蛋白结构的稳定，也影响着胶原蛋白功能的发挥。皮革工业中非常重要的一个加工过程是浸灰和再浸灰过程，用于完成皮革的脱毛和胶原蛋白纤维束的开解(软化)。传统的浸灰方法需要使用大量的石灰和硫化钠，由此产生的硫化物和石灰污泥造成了严重的环境污染。全球环境法规正在促使传统皮革加工业的改变，无石灰的酶脱毛法和以蛋白聚糖为靶点的酶纤维开解法正在兴起。酶处理方法不仅极大地减小了环境危害，还节省时间，改善劳动卫生条件。目前细菌碱性蛋白酶(用于脱毛)和淀粉酶(用于纤维开解)的工业应用已经取得了成功，处理效率和毛皮质量均可与传统化学方法相媲美。例如中国专利文献CN110408728A公开了一种脱毛酶制剂及应用其脱毛的方法，采用肝素酶、脂肪酶与WB600/KerT角蛋白酶按酶活比例3:3:5复配制备。但是，该专利依然存在对制革物质可能造成损害和纤维开解不足两个主要问题。因此，开发能够特异性去除胶原蛋白中不需要的纤维间物质以达到纤维开解且对胶原蛋白无降解活性、并具有胶原蛋白膨胀处理能力的新型蛋白酶是非常必要的。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种海洋来源的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9及其编码基因与应用。胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9对胶原蛋白有膨胀的特性但不降解胶原蛋白，在皮革工业加工过程中皮革脱毛和纤维开解以及医药、工业加工过程中胶原蛋白膨胀处理有很大的应用潜力。本专利技术还提供该胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的产生菌—海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613。本专利技术技术方案如下：一株海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613，该菌株2020年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCCNO:2020050。一种胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。根据本专利技术优选的，所述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因包括信号肽、前导肽、催化结构域和C端结构域的核苷酸序列。一种胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述SEQIDNo.3所示的核苷酸序列为上述SEQIDNo.1所示的核苷酸序列中的信号肽、前导肽和催化结构域的核苷酸序列。本专利技术中，上述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因来源于上述海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613。上述编码基因表达的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术中，上述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9来源于上述海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613。一种重组质粒载体，该重组质粒载体包含有上述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因。根据本专利技术优选的，所述的重组质粒载体的载体质粒为pET-22b(+)质粒。一种重组细胞，该重组细胞包含有上述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因。根据本专利技术优选的，所述重组细胞采用的宿主细胞为大肠杆菌；进一步优选为大肠杆菌BL21(DE3)。上述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9和/或胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因在皮革工业加工过程中皮革脱毛和纤维开解以及医药、工业加工过程中胶原蛋白膨胀处理中的应用。本专利技术的技术特点：本专利技术中的海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613从大西洋表层海水中分离得到，通过测定其全基因组，获得该菌注释过的全基因组和蛋白质组数据库。本专利技术首先分离纯化了Vibriopomeroyistrain12613所分泌的胞外蛋白酶，命名为胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9。对其进行Nano-LC-ESI-MS/MS分析，利用Vibriopomeroyistrain12613全基因组注释过的蛋白质数据库搜库分析确定了胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9前体的氨基酸序列(607aa)和编码前体的基因序列(1821bp)。利用CDD分析软件对前体的氨基酸序列进行分析表明，它包括信号肽(M1-H24)、前导肽(A25-H195)、M4家族催化结构域(A196-T507)和C端结构域(F529-V591)四部分。对胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9进行N端测序，利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)测定蛋白分子量大小，结果表明成熟的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9仅含有M4家族催化结构域(A196-T507)，共含有312个氨基酸。为了高效地生产胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9，设计引物利用PCR技术从海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613的基因组DNA中克隆了包含信号肽、前导肽和催化结构域(M1-T507)的基因片段VP9，共1521bp，并在大肠杆菌进行异源表达纯化，获得了胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的重组表达菌株。当用明胶为底物时，来源于Vibriopomeroyistrain12613(野生型菌株)和重组菌株的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9显示出相同的酶学性质，最适酶活温度为40℃，热稳定性良好，50℃以下孵育半小时酶活无明显下降。最适pH为8.0，在pH5.0～11.0范围内表现出很高的活性(≥80％)。耐盐性强，在4MNaCl中仍保持60％的活性。胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9能够显著膨胀胶原蛋白，但对胶原蛋白无降解活性。同时，胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9对维持细胞外基质结构稳定的胶原纤维间物质蛋白聚糖(饰胶蛋白聚糖)和糖蛋白(纤连蛋白)有降解作用。有益效果：1、本专利技术中的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9来源于海洋弧菌，是一种M4家族金属蛋白酶，热稳定性良好，50℃以下孵育半小时酶活无明显下降；耐盐性强，在4MNaCl中仍保持60％的活性，并且在pH5.0～11.0范围内均能表现出很高的活性(≥80％)。2、本专利技术中的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9对胶原蛋白有显著的膨胀功能，但对胶原蛋白无降解活性。原子力显微镜观察发现被膨胀过的胶原纤维能够解离出胶原原纤维束以及单根的胶原原纤维，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株海洋弧菌Vibrio pomeroyi strain 12613，该菌株2020年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCC NO:2020050。/n

【技术特征摘要】
1.一株海洋弧菌Vibriopomeroyistrain12613，该菌株2020年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，其菌种保藏编号为CCTCCNO:2020050。


2.一种胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


3.如权利要求2所述的胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，其特征在于，所述胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因包括信号肽、前导肽、催化结构域和C端结构域的核苷酸序列。


4.一种胶原蛋白膨胀蛋白酶VP9的编码基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，所述SEQIDNo.3所示的核苷酸序列为权利要求2所述的SEQIDNo.1所示的核苷酸序列中的信号肽、前导肽和催化结构域的核苷酸序列。


5.权利要求2或权利要求4所述的编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉忠，王琰，陈秀兰，刘白雪，宋晓妍，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37