一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置及其使用方法制造方法及图纸

本发明专利技术提供了一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置及使用方法。装置包括上层的密封盖、中层的微孔阵列、和下层的生化传感器芯片。使用时，注入微孔中的待测液体接触孔内下方的传感器，且不同微孔中的液体被密封盖密封而相互隔离。本发明专利技术可以将PCR反应分隔在上万个微小单元，微孔内进行单分子样本的PCR扩展反应，通过检测PCR过程中释放出的氢离子、磷酸根离子或焦磷酸根离子的浓度变化来检测阳性反应单元的数量，进而准确对DNA样品进行定量。本发明专利技术采用高度集成的半导体芯片来完成数字PCR的检测，不仅将反应体系大幅缩小，仪器小型化，并克服了对荧光激发和检测装置的依赖，且避免了荧光染料或荧光探针的使用，大幅降低了数字PCR的仪器及试剂成本。

A digital PCR amplification device based on microporous array chip and its application method

【技术实现步骤摘要】
一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置及其使用方法
本专利技术属于核酸检测领域，尤其涉及一种基于微孔阵列芯片的数字PCR检测方法。
技术介绍
现代生物学研究，特别是医学研究时常涉及对核酸定量分析的需求。比如检测血液中某些游离DNA及其含量，可以指导某些癌症的临床诊断，以及监控癌症的治疗效果。以往的定量主要采取荧光定量PCR进行相对定量，即选取一个表达稳定的基因的转录物作为参照，来评判目的核酸的量的高低。但这种方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干扰，只适用于定性或者低精度检测，无法满足某些含量特别稀少的目标核酸分子的检测。数字PCR(dPCR)则能通过大规模的平行PCR扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中提炼出来，以“终点信号的有或无”来统计被扩增的分子的个数。到目前为止，已经发展出了各式各样的dPCR装置，主要有孔板式和液滴式。孔板式dPCR就是在足够数量的同尺寸微孔阵列排布的平板上离散化核酸分子，实现数字化扩增。例如：ThermoFisher公司推出的QuantStudioTM3DdPCR系统就是采用这种方式。它在一块10mm边长正方形平板上蚀刻出高达20000个六角形微孔，每个微孔容积0.8nL，实现微孔间隔离，通过简单涂刷上样，每个微孔有1个左右的目标核酸分子；PCR后就可检测孔中荧光信号，通过泊松分布计算目标分子的个数。液滴式dPCR则是通过数以万计的单分散性小液滴来分割样本，液滴借助疏水的管道和油相液体，把DNA分散与各个油包水小液滴，一个液滴理论上只含有一个左右的DNA分子；DNA扩增后可以转移到荧光检测装置进行最终检测。该方法的缺点是液滴容易在PCR过程或者转移过程中出现液滴相互汇合的情况，导致结果不准确。以上各种dPCR的技术都采用荧光信号来读取结果，这就要求配套装置中含有昂贵的荧光激发装置和耗材、荧光高分辨率检测装置。另外，光信号的相互污染也会增加判断结果难度。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增方法。为解决上述技术问题，本专利技术提供一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，包括微孔阵列芯片本体，所述微孔阵列芯片本体包括密封盖、微孔阵列以及生化传感器，所述密封盖置于所述微孔阵列上方，用于密封微孔阵列的微孔并使各个微孔之间相互隔离，所述生化传感器置于微孔底部，所述密封盖或生化传感器上设有用于向微孔内溶液提供电压的电极。进一步，所述微孔阵列中含有0.1万～1000万个微孔，每个微孔的容积为1fL～10pL。进一步，所述生化传感器的表面涂有氢离子敏感材料、磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料。进一步，所述氢离子敏感材料为SiO2、Al2O3、HfO2、TiO2、Ta2O5、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、三乙氧基硅基十一醛中的一种或多种叠层。进一步，所述磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料为磷酸离子有机膜ISM或分子探针。进一步，所述生化传感器为离子敏感场效应晶体管，纳米线、石墨烯或二硫化钼晶体管传感器中的一种，或微型电化学传感器。进一步，还包括一读取装置，用于和计算机电气连接实现微孔阵列芯片本体PCR扩增后微孔内生化传感器电信号的读取。其中，作为一种技术方案，所述读取装置包括底座和上盖，所述底座内设有用于容纳微孔阵列芯片本体的凹槽，所述上盖的一侧边缘铰接在所述底座边缘处，所述底座内设有与微孔阵列芯片本体的生化传感器引脚pad形成电气连接的探针，所述底座下方设有电路板，用于连接探针，从而实现对微孔阵列芯片本体的供电及生化传感器电信号的数据读取；所述电路板包括数据采集模块、ADC芯片和处理器，所述数据采集模块采集微孔底部生化传感器的电信号，由ADC芯片进行模数转换后，输送给处理器进行数字信号处理并计算出扩增后DNA的浓度；所述处理器为FPGA、DSP、或ARM。作为另外一种技术方案，所述读取装置包括插卡电路板和数据处理电路板；所述插卡电路板包括用于容纳微孔芯片的容纳仓、置于容纳仓仓口的压盖、用于放大微孔芯片上生化传感器信号的信号放大器芯片以及和数据处理电路板进行通信的插头；所述数据处理电路板包括插槽、ADC模数转换芯片、微处理器MCU和通信端口，所述插槽与所述插头相配，通过插头与插槽的连接实现插卡电路板与数据处理电路板的通信，所述ADC模数转换芯片分别于所述信号放大器芯片和微处理器MCU相连，所述微处理器MCU通过通信端口和终端设备相连。本专利技术还提供一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置的使用方法，包括以下步骤：步骤一，加样：将DNA反应体系混合均匀后滴加到没有密封盖的微孔阵列芯片本体上，再用密封盖密封；步骤二，扩增：将微孔阵列芯片本体置于恒温PCR仪、变温PCR仪或热循环器上进行扩增反应；步骤三，信号读取：将扩增反应后的微孔阵列芯片本体置于读取装置内，读取微孔底部生化传感器的电信号、通过数据处理后获得DNA样本的初始浓度在计算机或显示屏上显示。其中，步骤三具体包括以下过程：3.1直方图分析：首先获得各个浓度的DNA样本对应微孔阵列芯片本体的数帧二维热力图数据；然后对每个微孔阵列芯片本体的数据分别求得一帧平均值热力图，对每一帧数据进行直方图Histogram分析，从而获得分布峰：若微孔中没有发生PCR扩增反应，则孔内的pH值未发生变化，传感器输出值为0，未发生扩增反应的微孔为阴性反应单元；若微孔中发生了单个DNA样本扩增反应，则孔内的pH值发生变化，发生单个DNA样本扩增反应的微孔为阳性反应单元；若微孔内pH值变化大于微孔内单个DNA样本扩增反应引起的pH值变化，则此微孔内为多个DNA样本发生PCR扩增反应；3.2DNA样本初始浓度的计算：由步骤3.1获得的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数计算DNA样本的初始浓度。进一步，步骤3.2的具体过程为：绘制标准曲线：根据各组DNA样本的浓度和对应的阳性单元个数N绘制标准曲线C＝f(N)；数据计算：将待测浓度的DNA样本进行PCR扩增反应后，首先根据步骤3.1计算微孔阵列芯片本体上所有的阳性传单元数量，然后根据步骤3.2预先绘制的标准曲线计算得到DNA样本的初始浓度。或者，步骤3.2的具体过程为：将直方图分析获得的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数带入泊松方程计算DNA样本的初始浓度。进一步，所述热循环器包括端盖和基座，所述端盖活动安装在所述基座的顶部；所述基座包括用于容纳微孔阵列芯片本体的放置腔、紧挨所述放置腔底部设置的导热块、设置在所述导热块上端部紧挨放置腔位置处的温度传感器、置于所述导热块底部的加热器、以及置于所述加热器底部的散热器；所述导热块两侧通过限位板固定在所述基座内，所述加热器通过定位板固定在所述导热块的底部，所述温度传感器和所述加热器通过控制电路与主控板相连。本专利技术所达到的有益技术效果：本专利技术直接通过电信号感应扩增反应过程中释放出来的氢离子、磷酸根离子或焦磷酸离子的浓度，无须对试剂荧光染色，因本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：包括微孔阵列芯片本体，所述微孔阵列芯片本体包括密封盖、微孔阵列以及生化传感器，所述密封盖置于所述微孔阵列上方，用于密封微孔阵列的微孔并使各个微孔之间相互隔离，所述生化传感器置于微孔底部，所述密封盖或生化传感器上设有用于向微孔内溶液提供电压的电极。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：包括微孔阵列芯片本体，所述微孔阵列芯片本体包括密封盖、微孔阵列以及生化传感器，所述密封盖置于所述微孔阵列上方，用于密封微孔阵列的微孔并使各个微孔之间相互隔离，所述生化传感器置于微孔底部，所述密封盖或生化传感器上设有用于向微孔内溶液提供电压的电极。


2.根据权利要求1所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述微孔阵列中含有0.1万~1000万个微孔，每个微孔的容积为1fL~10pL。


3.根据权利要求1所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述生化传感器的表面涂有氢离子敏感材料、磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料。


4.根据权利要求3所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述氢离子敏感材料为SiO2、Al2O3、HfO2、TiO2、Ta2O5、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、三乙氧基硅基十一醛中的一种或多种叠层。


5.根据权利要求3所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料为磷酸离子有机膜ISM或分子探针。


6.根据权利要求1所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述生化传感器为离子敏感场效应晶体管，纳米线、石墨烯或二硫化钼晶体管传感器中的一种，或微型电化学传感器。


7.根据权利要求1所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：还包括一读取装置，用于和计算机电气连接实现微孔阵列芯片本体PCR扩增后微孔内生化传感器电信号的读取。


8.根据权利要求7所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述读取装置包括底座和上盖，所述底座内设有用于容纳微孔阵列芯片本体的凹槽，所述上盖的一侧边缘铰接在所述底座边缘处，所述底座内设有与微孔阵列芯片本体的生化传感器引脚pad形成电气连接的探针，所述底座下方设有电路板，用于连接探针，从而实现对微孔阵列芯片本体的供电及生化传感器电信号的数据读取；
所述电路板包括数据采集模块、ADC芯片和处理器，所述数据采集模块采集微孔底部生化传感器的电信号，由ADC芯片进行模数转换后，输送给处理器进行数字信号处理并计算出扩增后DNA的浓度；所述处理器为FPGA、DSP、或ARM。


9.根据权利要求7所述的基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，其特征在于：所述读取装置包括插卡电路板和数据处理电路板；
所述插卡电路板包括用于容纳微孔芯片的容纳仓、置于容纳仓仓口的压盖、用于放大微孔芯片上生化传感器信号的信号放大器芯片以及和数据处理电路板进行通信的插头；
所述数据处理电路板包括插槽、ADC模数转换芯片、微处理器MCU和通信端口，所述插槽与所述插头相配，通过插头与插槽的连接实现插卡电路板与数据处理电路板的通信，...

【专利技术属性】
技术研发人员：岳耀斐，王晓飞，张志峰，
申请(专利权)人：成都万众壹芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51