一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针制造技术

本发明专利技术提供了一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针，该荧光探针化学结构特征如下：荧光团母体是萘酰亚胺类染料，萘酰亚胺发色团母体的内酰位点连接SNAP标签蛋白的底物BG基团，4位氨基连接铜离子受体DPA，具体结构如式(1)所示。该小分子荧光探针在嘌呤和DPA基团的淬灭作用下荧光微弱，其识别SNAP标签蛋白并与其共价连接后荧光恢复，此时加入Cu

A non washable fluorescent probe for the detection of copper ion in living cells

【技术实现步骤摘要】
一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针
本专利技术属于生物分析检测领域，具体涉及一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针。
技术介绍
铜是大多数生命形式所必需的微量金属元素，是人体中第三丰富的过渡金属。它在活性氧(ROS)的解毒、神经递质生物合成和变性、以及蛋白质结构稳定和功能维持等各种生物过程中起着关键作用。在这些生物体系中，铜以Cu2+或Cu+两种形式存在。Cu2+主要存在于胞外环境，Cu+则是胞内环境中许多蛋白酶的辅因子，例如其是线粒体中细胞色素c氧化酶的辅助因子，在有氧呼吸的最后阶段将氧还原为水。由于游离的Cu+具有很高的毒性，铜稳态平衡的破坏与各种疾病有关，包括威尔逊氏病、阿尔茨海默病和家族性肌萎缩性侧索硬化症等。因此，在活细胞中检测Cu+的方法得到了广泛的关注。自从第一种小分子传感器，CTAP-1，被开发出来用于检测活细胞中不稳定的铜离子，到目前为止，各种铜离子选择性小分子荧光探针已被广泛报道并应用于生物体检测。例如，以氟硼吡咯为母体的化合物CS1和CS3可以在急性铜超载条件下实时测量HEK293t细胞的Cu+摄取量；另外，基于近红外荧光的Cu+传感器被创造出来用于监测活细胞中外源性和内源性的Cu+离子；此外，探针ACu1被报道通过双光子激光共聚焦显微镜检测活细胞和活体组织中的铜离子。尽管如此，只有很少的报道研究Cu+离子的原位定点监测。蛋白标签荧光标记法是目前常用的活细胞内蛋白定点标记的方法，作用过程是首先将标签蛋白与目标蛋白的融合表达，随后带有底物基团的荧光小分子通过与标签蛋白的专一性作用实现标记。SNAP标签蛋白是常用的蛋白标签，SNAP标签蛋白能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤(常称作BG基团)通过亲和反应共价连接，因此连接有BG基团的荧光小分子能够专一、快速的与SNAP标签蛋白反应，进而标记目标蛋白。
技术实现思路
本专利技术一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针，该探针专一、快速的识别SNAP标签蛋白并与其共价连接。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与线粒体的COX8A融合在活细胞内表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而定位在线粒体。通过DPA基团对Cu+的响应检测线粒体Cu+含量。本专利技术一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针，该探针分子结构式如下：一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针的合成方法，合成路线如下：具体合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二吡啶亚甲基乙二胺。将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h。减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺。(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成将N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺。室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为10～100:1-的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺与、N,N-二吡啶亚甲基乙二胺的质量比为1:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺的质量与乙二醇甲醚的体积比为50-100:1mg/mL；步骤(2)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺、2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾质量比为1:1-3:0.5-2；N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为20-60:1mg/mL。一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针的应用，该荧光探针用于活细胞内对Cu+进行定点检测。一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针的应用，该荧光探针在体外对Cu+进行检测。所述的对Cu+进行定点检测的过程如下：(1)将SNAP标签蛋白与目标蛋白融合表达；(2)荧光探针通过与SNAP标签蛋白专一性共价连接实现对目标蛋白的标记；(3)利用DPA基团对铜离子的响应检测Cu+含量。本专利技术的优点和有益效果为：该小分子荧光探针在嘌呤和DPA基团的淬灭作用下荧光微弱，其识别SNAP标签蛋白并与其共价连接后荧光恢复，此时加入Cu+离子荧光再次淬灭。通过基因工程方法将SNAP标签蛋白与线粒体的COX8A融合在活细胞内表达，利用该小分子荧光探针与SNAP标签蛋白的专一识别进而定位在线粒体。通过DPA对铜离子的响应产生的荧光变化检测线粒体中Cu+含量，另外，标记后不需要清洗的步骤即可以直接应用，附图说明图1实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA核磁谱图氢谱；图2实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA核磁谱图碳谱；图3为实施例4中描述的由实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA(终浓度为2μM)与SNAP标签蛋白(4μM)在体外作用前后的荧光光谱图。图4为实施例6中描述的将实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA(终浓度为2μM)加入含有SNAP标签蛋白(2μM)的HEPES溶液中的动力学光谱图。图5为实施例7中描述的将实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA(终浓度为2μM)与SNAP标签蛋白(4μM)在体外作用后加入各种金属离子后的荧光光谱图。图6为实施例8中描述的将实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA(2μM)加入转染了pSNAP-Cox8质粒的Hela细胞中，并且加入Cu+(20μM)在不同的时间进行荧光共聚焦成像。图7为实施例10中描述的将实施例3制备的荧光探针BGAN-DPA(2μM)加入转染了pSNAP-H2B质粒的Hela细胞，并且加入Cu+(20μM)在不同的时间进行荧光共聚焦成像。具体实施方式下面的实施例将对本专利技术予以进一步的说明，但并不因此而限制本专利技术。实施例1用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光探针的制备，中间体BA-DPA的合成：将BA-Br(300mg,0.76mmol)溶于5mL乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二吡啶亚甲基乙二胺(DDPA)(150mg,0.62mmol)。反应液被缓慢加热至100℃,并在氮气保护下反应10h。减压除去溶剂，残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷：甲醇＝40：1,V/V)得黄色粉末182mg，产率44％。用于免洗标记特定蛋白质的SNAP荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针，其特征在于该探针分子结构式如下：





2.根据权利要求1所述的用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针的合成方法，其特征在于合成步骤如下：(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-1,8-萘酰亚胺，溶于乙二醇甲醚中，并向其中加入N,N-二吡啶亚甲基乙二胺；将反应液缓慢升温至100-140℃，并在氮气保护下反应10-24h；减压除去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为30～200:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂，得棕黄色固体N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺；
(2)SNAP蛋白的荧光探针的合成
将N-(4-羟甲基)苄基-4-(N,N-二吡啶亚甲基)乙二胺基-1,8-萘酰亚胺，叔丁醇钾，2-氨基-6-(N-甲基)四氢吡咯基鸟嘌呤、叔丁醇钾置于史莱克瓶中，氮气置换2-5次后加入2-10mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺；室温反应2-10h后，加压出去溶剂，硅胶柱分离，以体积比为10～100:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂，除去溶剂得靶向SNAP蛋白的荧光探针。


3.根据权利要求1所述的一种用于活细胞内铜离子定点检测的免洗荧光探针的合成方法，其特征在于步骤(1)中，N-(4-羟甲基)苄基-4-溴...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，乔庆龙，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21