一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法技术

本发明专利技术属于生化分析与药物筛选技术领域。涉及用于铀促排药物体外筛选的方法，尤其涉及一种基于竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定促排药物与金属硫蛋白(MT1/2)竞争结合U(VI)或Zn

Competitive enzyme-linked immunosorbent assay for in vitro screening of U (VI) - promoted drug effluents

【技术实现步骤摘要】
一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法
本专利技术属于生化分析与药物筛选
涉及用于铀促排药物体外筛选的方法，具体涉及一种用于铀(U)(VI)促排药物(螯合剂类)药效及其对机体Zn2+稳态影响的体外筛选方法，尤其涉及一种基于竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)测定促排药物与金属硫蛋白(MT1/2)竞争结合U(VI)或Zn2+作用的方法，
技术介绍
现有技术公开了铀及其化合物在核工业和军事上的用途非常广泛，铀内污染人体的潜在危险及对人体健康的危害问题倍受世界各国所关注。研究显示，铀化合物通过吸入、食入或伤口进入人体后，通常以稳定的6价铀酰离子(UO22+，U(Ⅵ))的形式存在于体液中，在血液中易与无机酸、有机酸及血浆蛋白结合，经血液循环运输到肾脏和骨骼等主要蓄积靶器官而产生毒性作用。临床实践中采用螯合剂类药物加速体内铀的排出是其主要的治疗措施，但目前仍无有效的药物用于临床，因此寻求高效低毒的铀促排螯合剂一直是研究者们不懈努力的目标。研究公开了金属硫蛋白(MT)是人体富含半胱氨酸的低分子量的金属结合蛋白，有四种异构体，其中MT1和MT2主要由肝脏和肾脏合成，受Zn2+的正向调控，也是维持细胞内Zn2+稳态的重要蛋白，它们主要分布于细胞的胞浆中，亦存在于细胞核中，还有少量存在于细胞外液如血浆、胆汁和尿液中，在重金属解毒及微量元素代谢中发挥重要作用。有研究报道，内源性MT通过与重金属镉(Cd2+)螯合形成无毒性的Cd-MT复合物由尿排出体外，从而降低Cd2+对小鼠的肾毒性；预防性给予ZnSO4诱导大鼠内源性MT高表达，亦能明显促进尿贫铀(DU(Ⅵ))排出及降低肾DU(Ⅵ)蓄积，对DU(Ⅵ)致肾损伤有较好的保护作用，表明MT亦能通过与U(Ⅵ)结合形成无毒或低毒的U(Ⅵ)-MT螯合物经尿排出体外而发挥机体的自我保护功能。但又有研究发现，血液循环中的Cd-MT复合物还可被肾小管上皮细胞重吸收，在溶酶体内降解分离，释放出游离Cd2+直接对细胞的结构和功能造成损伤，提示内源性MT对重金属Cd2+的肾毒性具有减轻或加重的双向作用；与之相似，U(Ⅵ)与金属转运蛋白复合物包括U(Ⅵ)-MT复合物通过血液循环运输到肾脏，经肾小球滤过后大部分可被肾小管上皮细胞重吸收，在溶酶体中解离形成磷酸铀晶体，随着该晶体的生长导致溶酶体破坏，释放出游离U(Ⅵ)导致细胞损伤；由此表明内源性MT对机体的保护作用是有限的，必须给予促排药物才能达到更为有效的治疗效果，而螯合剂与内源性MT竞争螯合U(Ⅵ)的作用是影响螯合剂排铀效果的关键因素之一。迄今为止，已公开有多种基于ELISA法检测生物样品包括血清、血浆、尿液、组织匀浆和细胞上清液等相关液体样本中MT含量的方法，如竞争ELISA法、双抗体一步夹心ELISA法等；以及基于鱼MT含量检测ELISA法用于监测水体生态环境中Cd2+等重金属污染程度的方法；还有研究报道，Cd2+、Zn2+与MT抗体对MT的结合存在竞争作用，等；具有简便、快速、廉价、用药量少、高通量和便于推广应用的优点，但尚未见相关竞争ELISA法用于放射性核素U(Ⅵ)促排药物药效及其对机体Zn2+稳态影响的体外筛选的报道。基于现有技术的现状与基础，本申请的专利技术人拟提供新的用于铀促排药物体外筛选的方法，具体涉及一种用于铀(U)(VI)促排药物(螯合剂类)药效及其对机体Zn2+稳态影响的体外筛选方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有U(VI)促排药物的药效筛选及对体内微量元素Zn2+稳态影响的筛选主要采用动物实验进行评价，存在用药量大、需时长、费用高、无法满足高通量筛选等的缺陷，提供新的用于铀促排药物体外筛选的方法，具体涉及一种用于铀促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，尤其是一种基于竞争ELISA法测定促排药物与MT1/2竞争结合U(VI)和Zn2+的能力，用于体外筛选U(VI)促排药物的药效及其对机体Zn2+稳态影响的方法，本方法具有简便、快速、高通量和费用低的优点。本专利技术的筛选U(VI)促排药物的药效及其对Zn2+稳态影响的方法，以U(VI)或Zn2+与MT1/2结合可干扰MT1/2抗原与MT1/2抗体结合致使吸光度值明显降低为基础，其中，先使U(VI)或Zn2+与MT1/2结合，再加入螯合剂，当螯合剂能竞争结合MT1/2结合的U(VI)或Zn2+时，则能使MT1/2抗原与MT1/2抗体结合的位点恢复，使MT1/2抗原与MT1/2抗体结合增加、与MT1/2抗体结合的酶标二抗增加、酶反应底物显色增多以致吸光度值增加；而当螯合剂对U(VI)或Zn2+的结合能力小于或等于MT1/2与U(VI)或Zn2+的结合能力时，无法使结合在MT1/2上的U(VI)或Zn2+解离或MT1/2与U(VI)或Zn2+的结合和解离处于动态平衡之中，以致无法增加MT1/2与MT1/2抗体的结合位点而对吸光度值无明显影响，因此，可通过吸光度值变化对铀促排药物的药效及其对机体Zn2+稳态影响进行体外筛选。具体的，本专利技术的U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，包括其促排效果的筛选及其对Zn2+稳态影响的筛选；其特征在于：将MT1/2抗原包被在酶标板上；4℃孵育过夜后用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭；洗板后加入一定浓度的U(VI)溶液或Zn2+溶液，37℃孵育后洗板；加入一定浓度的螯合剂，37℃孵育后洗板；加入特异性MT1/2单克隆抗体，37℃孵育后洗板；加入酶标二抗，37℃孵育后洗板；加入酶反应底物OPD，室温避光孵育后加入终止反应液2mol/L硫酸终止反应，然后用酶标仪在490nm处测定吸光度值。更具体的，本专利技术的筛选方法包括以下步骤：(1)用包被缓冲液(0.1mol/L碳酸盐缓冲液(CBS)，pH9.6)溶解及稀释MT1/2至0.6～2μg/mL，优选1～2μg/mL，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜；(2)用PBST，其中含0.05％Tween20的磷酸盐缓冲液，洗板3次，5min/次，弃液拍干；用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液作为封闭液，200μL/孔，4℃封闭过夜；(3)封闭结束后，弃液拍干，加入150～600μmol/L(优选300μmol/L)的U(VI)溶液或Zn2+溶液，100μL/孔，37℃孵育3h；(4)U(VI)溶液或Zn2+溶液处理结束后，用PBST洗板3次，弃液拍干，加入一定浓度的螯合剂，100μL/孔，37℃孵育0.5～3h；(5)螯合剂处理结束后，用PBST洗板3次，弃液拍干，加入0.5～2μg/mL(优选1～2μg/mL)的MT1/2抗体(一抗)，100μL/孔，37℃孵育1～3h；(6)一抗孵育结束后，用PBST洗板3次，弃液拍干，加入1:1000～2000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，100μL/孔，37℃，孵育1h；(7)二抗孵育结束后，用PBST洗板3次，弃液拍干，每孔加入100μl新鲜配制的0.4mg/ml邻苯二胺(OPD)底物显色液(用pH5.5柠本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于：包括其促排效果的筛选及其对Zn

【技术特征摘要】
1.一种用于铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于：包括其促排效果的筛选及其对Zn2+稳态影响的筛选。


2.根据权利要求1所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，其包括：将MT1/2抗原包被在酶标板上；4℃孵育过夜后用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液封闭；洗板后加入一定浓度的U(VI)溶液或Zn2+溶液，37℃孵育后洗板；加入一定浓度的螯合剂，37℃孵育后洗板；加入特异性MT1/2单克隆抗体，37℃孵育后洗板；加入酶标二抗，37℃孵育后洗板；加入酶反应底物OPD，室温避光孵育后加入终止反应液2mol/L硫酸终止反应，然后用酶标仪在490nm处测定吸光度值。


3.根据权利要求1或2所述的铀U(VI)促排药物体外筛选的竞争酶联免疫吸附测定方法，其特征在于，通过下述步骤进行：
(1)包被：用包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)溶解及稀释包被抗原兔肝MT1/2至工作浓度，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液；
(2)洗板：以PBST为洗液，洗板3次，每次5min，300μL/孔，弃液拍干；
(3)封闭：以1％牛血清白蛋白为封闭液，200μL/孔，4℃封闭过夜；封闭结束后，弃液拍干；
(4)U(VI)或Zn2+处理：加入一定浓度的U(VI)溶液和Zn2+溶液，100μL/孔，37℃孵育3h；
(5)洗板：同步骤(2)；
(6)螯合剂处理：加入一定浓度的螯合剂，100μL/孔，37℃孵育0.5～3h；
(7)洗板：同步骤(2)；
(8)加一抗：加入一定浓度的鼠抗MT1/2单克隆抗体(一抗)，100μL/孔，37℃孵育1～3h；
(9)洗板：同步骤(2)；
(10)加酶标二抗：加入1:1000～2000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP(二抗)，100μL/孔，37℃孵育1h；
(11)洗板：同步骤(2)；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈红红，暴一众，张旭霞，王梦梦，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31