一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti‑OPN‑PEG‑Au，是由骨桥蛋白抗体和SH‑PEG‑COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH‑PEG‑COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。通过本发明专利技术所述制备方法制作的纳米探针可实现川崎病冠脉炎的在体成像，因此在冠脉瘤的预警方面具有良好的应用前景。同时制备简单，易于实现工业化生产。

A nano probe for CT imaging of Kawasaki disease and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用
本专利技术属于医学诊断试剂
，涉及一种医学诊断试剂中的分子探针及其制备方法，尤其是一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用。
技术介绍
川崎病(Kawasakidisease，KD)好发于6个月到5岁以下儿童，是危害较大且影响深远的血管炎症性疾病。它主要侵犯中、小动脉的血管壁，以冠状动脉为著，成为当今威胁儿童生命的主要心血管疾病。在川崎病所导致的众多心血管并发症中，冠脉损害事件的发生率和致死率占据榜首，而其中，由以冠状动脉瘤带来的后果最为严重。研究显示，在得不到及时治疗的情况下，约20％患儿会有冠状动脉瘤的形成，且有0.5％-1％的患儿会发生直径超过8mm的巨大动脉瘤，巨大动脉瘤一旦形成，康复概率微乎其微，导致缺血性心脏病、心肌梗死甚至猝死等严重后果。即便没有形成巨大动脉瘤，一旦冠脉血管壁发生病理改变，就有可能进而影响心肌功能。越来越多的病案报道了因为幼时的川崎病冠脉炎诱导的心肌炎以及成年后的心肌纤维化，并且一项针对60名因川崎病发生心梗的患者生存结局的研究显示，幸存的患者在10年后为84.6％，20年为79.4％，30年为62.7％。这些数据一方面证实了血管病变对于临床结局的重要性，另一方面也提醒我们：儿童时期因川崎病对冠脉血管壁产生的病理改变会一直伴随到成年，甚至引起严重后果。临床上目前可用于诊断动脉瘤的手段包括：超声心动图、冠脉造影、多层螺旋CT等，其中对于儿童这一特殊群体，超声心动图是最常用的检测方法。但这些检查往往只能诊断出已形成的动脉瘤，而对于形成动脉瘤前的血管相关病变无法识别。因此，如何有效的识别导致动脉瘤形成的血管病变，实现早期预警，是目前儿童川崎病相关研究中亟待解决的难题。川崎病的病理过程主要分为以下几个阶段：首先是病变初期的起始于血管腔内的急性血管炎，可见以中性粒细胞为代表的炎性细胞浸润，但未及全层。然后是淋巴细胞、巨噬细胞等，在被激活的同时会分泌炎症因子和蛋白酶如：弹性蛋白酶、基质金属蛋白酶等，引起胶原蛋白的降解和弹性纤维层的断裂等，进而引发动脉瘤。与之紧密联系的是肌纤维细胞的增殖，由血管外膜的成纤维细胞、血管中膜的肌纤维细胞等细胞表型转化后形成的肌纤维细胞大量增殖，形成血栓和肉芽，造成冠脉部分或完全阻塞，引发心梗。其中以巨噬细胞为代表的炎症细胞的激活和以肌细胞的增殖分化这两个过程是川崎病发生动脉瘤以及造成严重后果的重要病理机制，且这两个过程联系紧密。申请人课题组在前期研究中(QiaoR,QiaoH,ZhangYetal.MolecularImagingofVulnerableAtheroscleroticPlaquesinVivowithOsteopontin-SpecificUpconversionNanoprobes.ACSNano.2017Feb28；11(2):1816-1825.)发现：血管壁发生巨噬细胞浸润时，骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达量较高，血管壁胶原蛋白的含量也较低；反之，当血管壁的巨噬细胞浸润较少时，OPN表达量较低，而胶原蛋白的含量较高。预示着，血管壁的巨噬细胞聚集会诱导OPN的分泌。但是，当前还未有关于OPN能够作为靶向川崎病冠脉炎血管病变相关的纳米探针的任何报道。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针及其制备方法和应用，该制备方法操作简单，经本专利技术制得的纳米探针能够实现川崎病冠脉炎的在体成像，稳定性好，识别效能高。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：本专利技术公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au，是由骨桥蛋白抗体和SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。优选地，所述的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒的平均直径为15nm，大小均一，Zeta电位为-32.8mv，颗粒的最大吸收为521nm。本专利技术还公开了一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，包括以下步骤：1)在Au纳米颗粒中加入SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团；2)将偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒加入2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)中，然后加入骨桥蛋白抗体，37℃摇床吸附处理1h后加入EDC，于37℃摇床振荡过夜，经离心分离，制得骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au。优选地，所述的Au纳米颗粒为平均粒径为15nm的Au纳米颗粒。进一步优选地，平均粒径为15nm的Au纳米颗粒的制备方法如下：用250mL的圆底三颈瓶称取192mLH2O，加入2mL1％HAuCl4，搅拌650rpm，加热煮沸，冷凝回流，加入6mL1％柠檬酸钠，继续搅拌反应15min。优选地，步骤1)中，Au纳米颗粒与SH-PEG-COOH的用量比为200mL：160mg；制得的表面带有羧基官能团的Au纳米颗粒的浓度为1mg/mL。具体地，步骤1)的制备过程如下，在200mL15nmAu纳米颗粒中加入160mgSH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团。将修饰上SH-PEG-COOH的15nmAu纳米粒子用100KD的超滤管超滤浓缩纯化，最后定容于10mL，使得Au纳米粒子的浓度为1mg/mL，并且过0.22μm滤膜除菌。优选地，步骤2)中，反应用量配比为：按照每4mL偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒中加入4mL100mMMES，加入1mg骨桥蛋白抗体，加入160μL的EDC；其中，骨桥蛋白抗体的浓度为30mg/mL；EDC的浓度为240mg/mL。具体地，步骤2)的制备过程如下，取4mL偶联SH-PEG-COOH的15nmAu纳米颗粒(1mg/mL)加入4mL100mMMES，pH＝4.8，加入1mgOPN抗体(30mg/mL，33μL),于37℃摇床吸附1h，加入EDC240mg/mL,160μL，于37℃摇床振荡过夜。将反应过夜的15nmAu纳米颗粒采用22000g离心30min，去除上清，用0.02MPBS清洗2遍，分散在含有BSA的抗体金纳米粒子保存液中，保存液中含有的BSA会进一步对偶联EGFR抗体的Au棒表面非特异性吸附位点进行封闭。本专利技术还公开了上述用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的应用，所述纳米探针用于川崎病冠脉炎的成像，具体通过选取与冠脉炎血管病变密切相关的关键分子OPN，从分子水平识别病变部位。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术公开的纳米探针，基于分子影像技术平台，选择与川崎病冠脉炎关系密切的OPN抗体为靶向分子，并利用生物相容性优良的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒作为载体，设计并本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，其特征在于，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au，是由骨桥蛋白抗体和SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，其特征在于，该纳米探针为骨桥蛋白靶向的纳米探针anti-OPN-PEG-Au，是由骨桥蛋白抗体和SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒缩合而成，骨桥蛋白抗体的活性氨基与SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒表面的活性羧基缩合相连。


2.如权利要求1所述的用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针，其特征在于，所述的SH-PEG-COOH修饰的纳米金颗粒的平均直径为15nm，大小均一，Zeta电位为-32.8mv，颗粒的最大吸收为521nm。


3.一种用于川崎病冠脉炎CT成像的纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在Au纳米颗粒中加入SH-PEG-COOH，充分搅拌均匀，于室温静置反应过夜，使Au纳米颗粒表面带有羧基官能团；
2)将偶联有SH-PEG-COOH的Au纳米颗粒加入2-(N-吗啉)乙磺酸中，然后加入骨桥蛋白抗体，37℃摇床吸附处理1h后加入EDC，于37℃摇床振荡过夜，经离心分离，制得骨桥蛋白靶向的纳米探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔红玉，张若涵，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61