本发明专利技术公开了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用，属于医学和生物医学工程领域。该方法包括以下步骤：提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，制备胶原冻干样品；将所得胶原冻干样品剪碎后采用酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品‑酸溶液；将所得鳄鱼皮胶原冻干品‑酸溶液置于4℃以下的环境溶解，并在4℃以下采用碱溶液将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。本发明专利技术提供了一种爬行类动物无免疫原性的胶原水凝胶的制备方法，所得水凝胶可以用于关节软骨缺损的修复以及治疗，可以降低朊病毒和病毒疾病的传播，避免应用过程中引起自身免疫反应，提高了软骨缺损修复的有效性和安全性。
Preparation method of crocodile skin glue raw water gel and its application
【技术实现步骤摘要】
一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及其应用
本专利技术涉及涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用。
技术介绍
关节软骨缺损一直是骨科临床的治疗难题，主要是因为关节软骨没有血供，且软骨细胞埋于稠厚的细胞外基质中，无法移动到损伤部位参与修复。传统的治疗如关节内清理和灌洗术等难以获得满意的临床效果。组织工程技术通过种子细胞复合支架材料构建组织工程化软骨，植入到缺损部位而实现治疗目的。胶原水凝胶作为软骨主要成分之一，具备理想的生物相容性及成软骨性能。目前应用于软骨组织工程的胶原水凝胶主要来源于哺乳动物，包括牛皮、猪皮及鼠尾胶原。然而，哺乳动物源性基质可能传播朊病毒和病毒疾病(C.R.Trevitt,P.N.Singh,VariantCreutzfeldt-Jakobdisease:pathology,epidemiology,andpublichealthimplications,AmericanJournalofClinicalNutrition,2003；78(3Suppl):651S-656S)。此外，哺乳动物源性胶原可能引起自身免疫反应(E.K.Choi,P.A.Gatenby,N.W.Mcgill,J.F.Bateman,W.G.Cole,J.R.York,AutoantibodiestotypeIIcollagen:occurrenceinrheumatoidarthritis,otherarthritides,autoimmuneconnectivetissuediseases,andchronicinflammatorysyndromes,AnnalsoftheRheumaticDiseases,1988；47(4):313-22)。Courtenay等(J.S.Courtenay,M.J.Dallman,A.D.Dayan,A.Martin,.,B.Mosedale,.ImmunisationagainstheterologoustypeIIcollageninducesarthritisinmice,Nature,1980；283(5748):666-8)使用牛皮胶原诱导小鼠关节炎(CIA)模型，已经用于研究自身免疫疾病模型构建超过30年。
技术实现思路
本专利技术提供了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法及应用，能够解决上述现有技术问题中的一种或几种。根据本专利技术的一个方面，提供了一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，包括以下步骤：(1)提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，并制备胶原冻干样品；(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎；(3)将经步骤(2)处理后所得到的胶原材料采用醋酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液；(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液置于4℃以下的环境中进行溶解，充分溶解后在4℃以下的环境中采用碱溶液将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。由此，通过本方法可以制备鳄鱼皮的无免疫原性的胶原水凝胶，可以用于关节软骨缺损的修复以及治疗，所得胶原水凝胶来源于两栖爬行类动物，一方面可以降低朊病毒和病毒疾病的传播，另一方面还可以避免应用过程中引起自身免疫反应，提高了软骨缺损修复的有效性和安全性。在一些实施方式中，步骤(1)中提取低免疫原性鳄鱼皮胶原，以及制备胶原冻干样品包括以下步骤：①取新鲜的鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪碎，一般可剪为细丝条状，将剪碎的鳄鱼皮装入锥形瓶中；②将脱脂液(乙醇:氯仿＝1:1)按5～8:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；③用EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢充分后用NaCl溶液进行彻底清洗；④将步骤③中所得的鳄鱼皮用醋酸溶液浸泡溶胀；⑤称取适量胃蛋白酶，用HCl溶液溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，在低温震荡摇床上进行酶消化4～7天，在消化期间可隔天加入适量醋酸促使消化完全；⑥将步骤⑤所得的混合物进行离心去除沉淀物，收集上层溶液并用NaOH溶液调至pH＝8～8.5，酶失活后，再用HCl溶液将上述溶液的pH值调至2～2.5；⑦称取适量的NaCl粉末研细后边搅拌边加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；⑧待充分盐析后，通过低温高速离心机进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；⑨用HCl溶液将步骤⑧的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；再次称取适量NaCl粉末研细边搅拌边加入到步骤⑨所得的粗提胶原溶液中进行盐析处理；待充分盐析后，通过低温高速离心机进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；将步骤中所得的胶原沉淀物装入透析袋，并于蒸馏水中透析，每天换水并低温振荡，待pH接近中性后，在将其真空冷冻干燥得到胶原冻干样品；步骤①～步骤均在4℃以下操作。由此，提供了一种鳄鱼皮胶原的提取方法，按照上述方法提取鳄鱼皮中的胶原可以提高所得胶原样品的纯度。并且，此提取方法简单，对设备的要求不高，易于操作。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原提取的方法中，步骤③中所述EDTA-NaOH溶液的浓度为10％，所述NaCl溶液的浓度为10％；步骤④中醋酸溶液pH＝2；步骤⑤和步骤⑨中所述HCl溶液pH＝2；步骤⑥中所述NaOH溶液的浓度为2mol/L，所述HCl溶液的浓度为2mol/L；步骤中所述透析袋的分子量为8000～14000。由此，可以保证鳄鱼皮胶原有较高的提取率，并且提高所得胶原样品的纯度。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(2)还包括采用紫外线照射进行杀菌的操作；步骤(3)中所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液的浓度为10～15mg/mL。步骤(2)中紫外线照射杀菌可以保证胶原冻干样品的卫生情况，提高所得水凝胶的安全性。步骤(3)中鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液的浓度为10～15mg/mL可以保证胶原材料的溶解效果。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中采用浓度为0.4～0.6mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；步骤(4)中采用0.5～1.5mol/L的NaOH溶液调节pH值。采用低浓度的弱酸溶解胶原材料，可以保证胶原材料的溶解效果，并且不会影响胶原品质。低浓度的NaOH溶液调节pH值，可以避免整个体系pH波动过大，从而保证胶原品质。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中采用浓度为0.45～0.55mol/L的醋酸溶液作为溶剂溶解胶原材料；步骤(4)中采用0.6～1.2mol/L的NaOH溶液调节pH值。由此，可以缩短溶解时间，并进一步提高鳄鱼皮胶原水凝胶的产量，保证水凝胶的品质。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(4)中还包括将所得的pH＝6.8～7.2的溶液置于37℃恒温条件下静置的操作。由此，可以促进鳄鱼皮胶原水凝胶成品的成型。在一些实施方式中，鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法中，步骤(3)中所用醋酸溶液与步骤(4)所用NaOH溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)提取鳄鱼皮胶原，并制备胶原冻干样品；/n(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎；/n(3)将经步骤(2)处理后所得到的胶原材料采用醋酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液；/n(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液置于4℃以下的环境进行溶解，溶解后将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。/n
【技术特征摘要】
1.一种鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取鳄鱼皮胶原，并制备胶原冻干样品；
(2)将(1)中所得胶原冻干样品剪碎；
(3)将经步骤(2)处理后所得到的胶原材料采用醋酸溶液进行溶解，得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液；
(4)将步骤(3)所得鳄鱼皮胶原冻干品-酸溶液置于4℃以下的环境进行溶解，溶解后将其pH值调节至6.8～7.2，得到液态或半固态的水凝胶。
2.根据权利要求1所述的鳄鱼皮胶原水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述胶原冻干样品的制备方法包括以下步骤：
①取鳄鱼皮去除角质层和脂质层，将剩下的部分剪碎，并装入锥形瓶中；
②将脱脂液按5～8:1(V/V)加入步骤①的锥形瓶中进行脱脂处理，脱脂完全后用乙醇清洗；
③用EDTA-NaOH溶液对经过步骤②处理的鳄鱼皮进行浸泡除垢，除垢后使用NaCl溶液清洗；
④将步骤③所得中的鳄鱼皮用醋酸溶液浸泡溶胀；
⑤称取适量胃蛋白酶，用HCl溶液溶解后加入到步骤④的锥形瓶中，进行酶消化4～7天；
⑥将步骤⑤所得的混合物进行离心去除沉淀物，收集上层溶液并用NaOH溶液调至pH＝8～8.5，酶失活后，再用HCl溶液将pH值调至2～2.5；
⑦称取适量NaCl加入到步骤⑥的溶液中进行盐析处理；
⑧待充分盐析后，将步骤⑦中所得混合物进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；
⑨用HCl溶液将步骤⑧中所得的沉淀物完全溶解，得到粗提胶原溶液；
⑩0再次称取适量NaCl加入到步骤⑨中所得的粗提胶原溶液中进行盐析处理；
待充分盐析后，将步骤⑩0中所得混合物进行离心处理，收集沉淀物，弃去上清液；
将步骤中所得的胶原沉淀物装入...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑立，陆真慧，罗世兴，朱必康，赵劲民，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45
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