稳定同位素标记的核酸作为内标物的核酸定量方法及其用途技术

为了定量分析样品或者复杂介质内存在的核酸，核酸提取或者精制过程不要的。但是核酸提取及精制收率(yield)根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。所以核酸的提取及精制收率的有效归一化(normalization)成为以原样品为基准的正确定量分析核酸的必要条件。本发明专利技术是有关没有目标核酸的增幅，对存在于样品或者复杂介质内的核酸进行定量分析的方法。

Nucleic acid quantitative method and application of stable isotope labeled nucleic acid as internal standard

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定同位素标记的核酸作为内标物的核酸定量方法及其用途
本专利技术是有关提高了准确度和可靠性的核酸(Nucleicacids；DNA及RNA)的定量分析方法，具体是有关利用稳定同位素(stableisotope)标记的核酸(stableisotopelabellednucleicacids(DNAorRNA)；以下称为'SILD')为内标物(internalstandard)的核酸定量分析方法。
技术介绍
基因分析包括根据PCR和排序(sequencing)技术扩增基因和分析其碱基序列过程。基因分析在以下领域中广泛被利用。如，疾病诊断、突变检测、病原性细菌和病毒的检测等医学领域；基因变形农产品检测，食材原产地判别，污染于食材的微生物检测等食品及卫生领域；如微生物群集分析、对生物体的毒性分析、生物多样性保存的环境领域；亲子判别、个人识别、犯罪嫌疑人识别等法医领域。通过新一代碱基测序(nextgenerationsequencing；NGS)技术开发，可对数十、数百个不同样品，也可进行同时对数千、数万个遗传基因分析的高效率遗传基因组(genome)分析。NGS技术在很多领域有效被利用。包括根据全转录组测序的所有遗传基因表达谱分析及大规模、高精密度微生物群集分析；根据同类群组分析的集团遗传特性和疾病标记发掘；根据个人遗传基因分析的疾病预测等个体化医学等领域。最近血液内‘循环核酸或者自由核酸(circulatingcellfreenucleicacid)’被发现。通过后续研究还发现了循环核酸具有很大的医学意义，因此为了利用循环核酸的精密分析法的必要性突显。在正常状态下血液中的循环核酸的量为20-100ng/ml,但是如果发生乳房癌、血癌等癌症的时候会出现大幅增加到200-500ng/ml的现象。具有些报告显示不仅对癌症在心肌梗塞、感染、急性炎症、过度运动及压力中也会出现循环核酸量变化的现象。即具有了单纯只通过测定血液中的循环核酸量也可以早期诊断主要疾病的可能性。为此，首先需要对血液中循环核酸进行正确并可靠的定量分析。核酸定量法一般使用紫外光谱法(UVspectrometry)定量聚合酶链反应(quantitativerealtimepolymerasechainreaction；qPCR)数码聚合酶链反应(digitalPCR)及荧光定量法等。所述定量法因为受到样品或者介质中存在的其他成分的阻碍，没有精制过程时无法正确定量分析核酸的量。但是对于复杂介质中的核酸，准确度和可靠性高的定量分析法还没被开发出来。专利文献1公开了一种核酸的定量方法。该核酸定量方法以如下阶段构成。把与样品中的被分析物质核酸能区分并且能和该核酸同时能扩增的多种核酸构建体，以不同量各添加到样品里的阶段；使用能与所述被分析物质核酸和核酸构建体反应的扩增试剂，把所述样品以核酸扩增步骤来处理的阶段；从所述相对量计算被分析物质核酸量的阶段。所述各个核酸构件体都不同；各个核酸构建体可以区分开来并且也能与被分析物质核酸也能区分开来。核酸构建体在能与相同的扩增试剂反应的这一特点，与核酸构建体和被分析物质核酸类似。但是所述方法会根据在校准曲线制作中的使用的各种核酸构建体的分析中的核酸而发生变化，并且核酸构建体具有要与被分析物相同速度扩增的前提，因此不能认为是具有可靠的定量分析方法。专利文献2公开了一种有关为生成校正曲线而可计算目标核酸的特性水平的，一般的基准核酸的使用。专利文献2是有关导入被标识为公示量荧光段的普遍基准核酸的定量方法。这与专利文献1一样，因具有用在校准曲线的核酸要以相同速度扩增的前提，所以存在基本错误。如所述，没有目标核酸的扩增也可以精确定量核酸的方法至今还没公开。【现有专利文献】(专利文献1)韩国专利注册公报第10-0312800号(专利文献2)韩国专利注册公报第10-2017-0083053号
技术实现思路
技术问题为了定量分析样品或者复杂介质内的核酸，需要有核酸的提取或者精制过程。但是核酸的提取率和精制率会根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。因此核酸的提取和精制收率的有效归一化(normalization)是，以原样品为基准的准确定量分析核酸的必要条件。本专利技术的目的在于没有目标核酸的扩增，定量分析样品或者存在于复杂介质内的核酸量的方法。解决问题的手段本专利技术的主要目的是为提供一种能提高样品中核酸(Nucleiceacids；DNA或者RNA)定量分析的准确度和可靠行的方法，具体是有关把SILD做为内标物(internalstandard)的核酸定量分析方法。为了准确定量分析存在于样品或者介质内的核酸，需要核酸提取或者精制过程。但是核酸的提取率和精制率根据精制原理、使用的套组及样品的特性有很大的变动性。因此核酸的提取及精制率的有效归一化(normalization)是把原样品做为基准的准确定量分析核酸的必要条件。本专利技术是有关在核酸精制及预处理过程中，为了收率的归一化而把SILD使用为内标物的分析方法。为了间接归一化核酸提取和精制率而利用较多的方法是，把已知量的特定遗传基因作为内标物添加到样品里，经提取及精制后，再测定遗传基因量，从而计算提取及精制率。这种方法精制对象核酸具有多种尺寸的状态下，所添加的作为内标物的核酸具有单一尺寸，但是核酸提取率很大程度上受核酸的大小的影响，所以这种方法具有难于利用在整体提取率归一化的缺点。并且还有一种方法是，为了解决这种大小问题，把大小、分布相同的已知量核酸作为外部标准物质，对此另行进行提取及精制反应并定量分析，从而根据套组、实验者等来预测收率。但这种方法，因为根据每个反应容器和样品的介质形态不同而具有不同的精制率，所以也不能确定是一种完美的归一化方法。为了克服所述已有方法的缺点，本专利技术进行了，即作为内标物，也可以对整个精制效率进行归一化方法的专利技术。本专利技术是有关对核酸提取及精制收率进行归一化的方法，把SILD作为内标物。SILD虽然与作为分析对象的普通的核酸具有相同的化学，生物特性，但是因为稳定同位元素(13C,15N)而发生分子量的差异。并且，这些差异在最终分析仪器(重量分析仪)中，可以以不同质量-电荷之比(m/z)被检测及定量。即，对各个样品中算出的正常核酸的量和内标物核酸量，可以同时并且区分开里进行定量。样品中算出的内标物特性因为与分析对象核酸的提取、精制、酶反应、定量分析的效率相同，所以内标物的信标对相同反应，作为分析对象物质拥有的反应效率的尺度。如果预先知道作为内标物的核酸的量或者往核酸定量标准物质添加相同量的内标物，这种分析方法一本称为同位素稀释质谱法(isotopedilutionmassspectrometry)，这在分析化学领域利用为物质定量分析法。但是同位素稀释质谱法必须准备被分析对象物质置换为同位元素的内标物。在分析化学领域，主要对象的物质因为分子量小、结构单纯，置换为同位元素的内标物准备相对容易，从工业用试剂公司也可以容易购买。但是核酸，因为分子量非常本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸的定量分析方法，包括：/n1)被

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171030 KR 10-2017-01425091.一种核酸的定量分析方法，包括：
1)被13C和/或者15N的稳定同位元素置换的核酸(SILD)的准备阶段；
2)把所述被置换的核酸(SILD)作为内标物，往分析对象样品和对照群样品里各添加相同量的阶段；
3)从所述分析对象样品及所述对照群获得核酸的阶段；
4)把从所述3)阶段获得的核酸，以单一核苷水平加水分解的阶段；
5)在质量分析中，从所述4)阶段获得的核苷，获得与正常核苷置换的核酸(SILD)中的核苷检测值的阶段；
6)利用所述被置换核酸(SILD)中的核苷的检测值应该与分析对象和对照群样品中的一样的特性，对分析对象样品核酸的量进行归一化的阶段。


2.根据权利要求1所述的定量分析方法，其特征在于，所述的核酸指的是DNA或者RNA，样品指的是以下物质中的至少一种以上，所述物质包括全血、血浆、血清、尿、唾液、汗、牛奶、动物提取液、植物提取液、细胞提取液、细胞培养液、饮用水、自来水、河水、江水、海水中，至少一种以上。


3.根据权利要求2所述的定量分析方法，其特征在于，所述核酸是DNA，所述样品是血清。


4.根据权利要求1所述的定...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨仁哲，权何订，郑智鲜，裵姈敬，
申请(专利权)人：韩国标准科学研究院，
类型：发明
国别省市：韩国;KR