本发明专利技术涉及一种检测血样中杜拉鲁肽浓度的方法，具体而言，是涉及一种快速测定杜拉鲁肽血药浓度的酶联免疫反应(ELISA)试验方法，方法可以用mouse anti‑human GLP‑1捕获性抗体捕获杜拉鲁肽，然后加入带有HRP的抗人FC端二抗，加入TMB显色进行检测。该方法缩短检测时间，同时提高检测的灵敏度。
An ELISA method of dulaglutide
【技术实现步骤摘要】
一种杜拉鲁肽ELISA检测方法
本专利技术涉及一种测血样中杜拉鲁肽浓度的方法，具体而言，是一种快速测定杜拉鲁肽血药浓度的酶联免疫反应(ELISA)试验方法。
技术介绍
糖尿病是一种慢性代谢性疾病，主要表现为高血糖，持续的高血糖是导致糖尿病并发症的主要因素，如视网膜、肾脏、神经系统及微血管并发症等。全球约有3.82亿糖尿病患者，预计2035年患者将达到6亿。糖尿病可分为胰岛素依赖型(1型糖尿病)和非胰岛素依赖型(2型糖尿病)。2型糖尿病患者约占总数的90％，对胰岛B细胞具有保护作用的新型药品成为这一领域的研究热点。患者体内细胞膜受体胰高血糖素样肽-1(Glucagon-likepeptide-1，GLP-1)的水平太低致胰岛B细胞受损，是2型糖尿病的重要致病因素。GLP-1是一种肠促胰岛素，主要由分布于空肠、回肠和盲肠的L细胞分泌，并由胰高血糖素原基因转录、翻译及加工而成。GLP-1由30或31个氨基酸残基组成，有GLP-1(7-36)和GLP-1(7-37)两种亚型，对天然GLP-1结构改造后可获得长效的GLP-1R激动药。近年来，美国FDA已批准包括杜拉鲁肽(Dulaglutide)等一系列GLP-1R激动药上市。杜拉鲁肽(商品名：)是由美国Lily公司研发的新型长效GLP-1R激动药，由两个具有DPP-4抑制作用的GLP-1类似物和人免疫球蛋白重链IgG4-Fc片段融合得到，其活性与内源性GLP-1相似，半衰期为5d，能有效延缓肾脏的清除作用。FDA于2014年9月批准杜拉鲁肽皮下注射液上市，主要适用于在饮食和体育锻炼基础上改善成人2型糖尿病患者的血糖控制水平。欧盟委员会于2014年12月批准杜拉鲁肽皮下注射液在欧洲上市。杜拉鲁肽属于融合蛋白，将两个具有二肽基肽酶抑制作用的GLP-1(7-37)C端与人免疫球蛋白IgG4-Fc可结晶蛋白片段N端通过小肽分子链连接，并进行特定的氨基酸位点修饰，包括将GLP-1(7-37)的第36位精氨酸(Arg36)以及IgG4-Fc片段重链的第234位苯丙氨酸(Phe234)、第235位亮氨酸(Leu235)、第228位丝氨酸(Ser228)分别替换成甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、Ala、脯氨酸(Pro)，并去掉IgG4-Fc碳端的赖氨酸(Lys)。氨基酸位点的修饰降低了lgG4-Fc与其受体的结合作用，减少了细胞毒性，提高了药物安全性。杜拉鲁肽通过与细胞膜表面的GLP-1R结合激活胞内相关信号转导通路，以葡萄糖依赖方式促进胰岛素合成及分泌，并减少胰高血糖素分泌，从而降低血糖。杜拉鲁肽能延缓胃排空，可能降低口服治疗药物的吸收率，联合治疗指数较窄的口服糖尿病药物时，需要给予足够密切的监测。但现有技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法都是放射性免疫方法(RIA)，放射性免疫方法(RIA)对实验室要求和实验人员要求高，操作复杂，时间长；同时方法的灵敏度不高，如文献《ClinicalPharmacokineticsofDulaglutideinPatientswithType2Diabetes:AnalysesofDatafromClinicalTrials》--ClinPharmacokinetDOI10.1007，采用放射性免疫方法(RIA)测定杜拉鲁肽，检测范围是5-50ng/ml；文献；文献《A5-weekstudyofthepharmacokineticsandpharmacodynamicsofLY2189265,anovel,long-actingglucagon-likepeptide-1analogue,inpatientswithtype2diabetes》也采用放射性免疫方法(RIA)测定杜拉鲁肽，检测范围是5-40ng/ml；这些方法灵敏度无法满足临床检测的需要；临床及科研开发急需一种灵敏度高，操作简单检测杜拉鲁肽血药浓度的方法，来满足现阶段杜拉鲁肽药物开发的需要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的缺陷，进行深入研究，提供一种检测杜拉鲁肽的方法，方法操作简单，灵敏度高；该方法采用酶联免疫反应(ELISA)技术，用GLP-1捕获性抗体捕获杜拉鲁肽，然后加入带有HRP的抗人FC端二抗，加入TMB显色进行检测；所述带有HRP的抗人FC端二抗为猴血清吸附二抗。所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其中所述GLP-1捕获性抗体为鼠抗人GLP-1捕获性抗体。所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其中所述采用的抗体铺板浓度为≥2μg/ml，优选所述采用的抗体铺板浓度为2μg/ml。所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其中所述采集的生物样品用血清稀释，采用的血清稀释倍数为≥50倍，优选所述采用的血清稀释倍数为50倍。所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其中所述猴血清吸附二抗以1:15000稀释。所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其中所述方法采用的抗体铺板浓度为2μg/ml，生物样品用血清稀释倍数为50倍，猴血清吸附二抗以1:15000稀释。以上所述采用酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，可用于哺乳动物在使用杜拉鲁肽制剂后，检测体内杜拉鲁肽的含量变化及代谢研究的用途。本专利技术提供的酶联免疫反应(ELISA)技术测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，是一种操作简单、结果准确、特异性好、灵敏度高的检测杜拉鲁肽血药浓度的测定方法。方法酶联免疫反应(ELISA)技术，用GLP-1捕获性抗体捕获杜拉鲁肽，然后加入带有HRP的抗人FC端二抗，加入TMB显色进行检测；所述带有HRP的抗人FC端二抗为猴血清吸附二抗。在酶联免疫反应(ELISA)技术方法中，带有HRP的抗人FC端二抗的选择具有非常重要的作用。本专利技术所述带有HRP的抗人FC端二抗，在测定杜拉鲁肽时有更好的和较好的色谱行为；采用本专利技术检测方法检测标准溶液样品中的痕量杜拉鲁肽或检测血浆样品中的杜拉鲁肽，最低检测限可达到0.4ng/ml。本专利技术具体通过以下技术方案实现：1.抗体包被96孔板：mouseanti-humanGLP-1抗体，PBS配制为2μg/ml，以100μl/孔，加入高吸附的96孔板中，4℃敷育过夜；2.BSA封闭：用PBST配制1％BSA封闭液，以200μl/孔，37℃封闭1小时；3.杜拉鲁肽(3mg/ml)标曲及质控的稀释:将配制好的标曲和质控样品以100μl/孔加入板中，37℃敷育2小时；4.样品的稀释：将需要测定的样品稀释至定量范围内(杜拉鲁肽免疫食蟹猴，抽取其血浆，处理得测定样品)。5.二抗：猴血清吸附二抗以1:15000稀释(1:20000稀释OD最高值不到1.5，1:10000稀释时OD值超过3，超过SpectraMax190酶标仪的准确测量范围，实验选择1：15000的稀释比例符合要求)，以100μl/孔加入本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其特征在于采用酶联免疫反应(ELISA)技术，用GLP-1捕获性抗体捕获杜拉鲁肽，然后加入带有HRP的抗人FC端二抗，加入TMB显色进行检测；所述带有HRP的抗人FC端二抗为猴血清吸附二抗。/n
【技术特征摘要】
1.一种测定杜拉鲁肽血药浓度的方法，其特征在于采用酶联免疫反应(ELISA)技术，用GLP-1捕获性抗体捕获杜拉鲁肽，然后加入带有HRP的抗人FC端二抗，加入TMB显色进行检测；所述带有HRP的抗人FC端二抗为猴血清吸附二抗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述GLP-1捕获性抗体为鼠抗人GLP-1捕获性抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述酶联免疫反应(ELISA)方法采用的抗体铺板浓度为≥2μg/ml。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述酶联免疫反应(ELISA)方法采用的抗体铺板浓度为2μg/ml。
5.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：余飞，孙百平，李玉梅，马淑丽，王涛，路晶晶，王建华，单莉娟，刘万卉，
申请(专利权)人：山东博安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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