一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用，包括提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序，序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选后测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记，筛选得到的欧山羊草引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。本发明专利技术可用于小麦背景下欧山羊草染色体、染色体片段等遗传成分的检测，通过简化基因组测序技术，可大规模快速地对小麦‑欧山羊草衍生系材料进行检测，且省时省力，花费少。

A method for obtaining specific molecular markers of Leymus chinensis and its application

【技术实现步骤摘要】
一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用
本专利技术属于分子标记筛选
，具体涉及一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用。
技术介绍
山羊草属(AegilopsL.)是小麦近缘植物中与小麦亲缘关系最为密切的属，在小麦进化中起着重要作用，并为小麦改良提供了一批优良基因。山羊草属由11个二倍体，10个四倍体和2个六倍体组成(VanSlageren,1994)，包括C、D、N、M、S和U基因组(MirzaghaderiandMason2019)。欧山羊草(Ae.biuncialis，2n＝4x＝28,UUMM)携带有抗旱、耐盐、抗病等优异基因，但目前，关于欧山羊草特异分子标记开发与检测进展较少。从108个小麦SSR标记中筛选到2个分子标记(GWM44和GDM61)可用于欧山羊草2Mb和3Mb染色体的检测；筛选到少数U和M基因组特异的COS(conservedorthologousset)标记；从48个PLUG标记当中筛选到5个欧山羊草1Ub特异的分子标记，以上报导均是利用已有的小麦分子标记信息开发而来，且开发效率低。同时，这些标记远远无法满足小麦背景下，欧山羊遗传成分的鉴定与检测。目前，尚未见有关欧山羊草特异分子标记及其开发的报道,欧山羊草特异分子标记的获得，可用于小麦背景下欧山羊草染色体、染色体片段等遗传成分的检测，可大规模快速地对小麦-欧山羊草衍生系材料进行检测，且省时省力，花费少。尚未见利用简化基因组测序技术进行欧山羊草特异分子标记的开发，本专利证实该方法可以高效用来开发欧山羊草特异分子标记，因此需要一种简化基因组测序技术大规模快速地小麦-欧山羊草衍生系材料进行检测欧山羊草特异分子标记获取方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种欧山羊草特异分子标记获取方法及其应用，为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术包括以下步骤：A提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序；B序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选；C测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记；筛选得到的欧山羊草(U和M基因组)引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上。D以小麦属植物基因组DNA为阴性对照，欧山羊草基因组DNA为阳性对照，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。进一步地，扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的TaqPCRMix，2μl的ddH2O；PCR扩增程序为：(1)94℃变性4min，(2)35个循环的普通PCR程序：94℃变性1min，58℃复性1min，72℃延伸1min；(3)72℃延伸5min；结束扩增，15℃保存；具体地，扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120V电泳分离。进一步地，以待测欧山羊草作为阳性对照，已知小麦的DNA作为阴性对照。具体地，所述检测结果的扩增产物在6％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上稳压120V电泳分离。进一步地，PCR扩增通过银染法获得具有欧山羊草特异扩增大小的特异条带。具体地，欧山羊草特异分子标记在基因组测序的应用，获得的欧山羊草特异分子标记，进一步以中国春基因组DNA为阴性对照，欧山羊草DNA(U和M基因组)，小伞山羊草DNA(U基因组)和卵穗山羊草DNA(M基因组)为对照，利用上述PCR扩增体系和程序以及电泳方法，获得的欧山羊草特异标记进行进一步的分类，以进一步明确每个分子标记的类型，更有针对性的用于小麦背景下山羊草遗传成分的检测，明确其类型，利用这些标记对其中一份小麦-欧山羊草衍生系材料WA317进行检测，获得该株系具有特异扩增的分子标记。本专利技术具有以下优点：本专利技术可用于小麦背景下欧山羊草染色体、染色体片段等遗传成分的检测，通过简化基因组测序技术，获得欧山羊草特异序列，并设计引物，筛选其特异分子标记，以检测小麦背景下欧山羊草遗传成分，加快欧山羊草优异基因在小麦遗传改良进程，可大规模快速地对小麦-欧山羊草衍生系材料进行检测，且省时省力，花费少。附图说明图1为欧山羊草特异分子标记开发与WA317分子标记扩增的目的产物的凝胶电泳图谱；具体实施方式下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外还应理解，在阅读了本专利技术所述的内容后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书限定的范围。本专利技术包括以下步骤：A提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序；B序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选；C测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记；筛选得到的欧山羊草(U和M基因组)引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上。D以小麦属植物基因组DNA为阴性对照，欧山羊草基因组DNA为阳性对照，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。获得的欧山羊草特异分子标记，进一步以中国春基因组DNA为阴性对照，欧山羊草DNA(U和M基因组)，小伞山羊草DNA(U基因组)和卵穗山羊草DNA(M基因组)为对照，利用上述PCR扩增体系和程序以及电泳方法，获得的欧山羊草特异标记进行进一步的分类，以进一步明确每个分子标记的类型，更有针对性的用于小麦背景下山羊草遗传成分的检测，明确其类型，利用这些标记对其中一份小麦-欧山羊草衍生系材料WA317进行检测，获得该株系具有特异扩增的分子标记。一方面，证实该株系中确实含有欧山羊草遗传成分，另一方面，具有特异扩增的标记可用于该株系的检测追踪，与原位杂交等方法相比，该方法更加方便、快捷，省时省力。本实施例中利用的基因组测序技术对欧山羊草材料Y17进行测序，开发欧山羊草特异分子标记。为了提高筛选特异性和有效性，我们将测序获得的SLAF标签与中国春参考基因组序列进行比对，将同源性小于50％的序列用于欧山羊草特异标记的开发。测序由北京百迈客生物科技有限公司负责，引物在上海生工生物科技有限公司合成。以欧山羊草Y17DNA作为阳性对照，中国春小麦DNA作为阴性对照，进行PCR扩增，从中筛选欧山羊草特异分子标记。PCR体系和方法参考Luan等(2010)。筛选得到的引物进一步利用小伞山羊草Y139(U基因组供体)DNA和卵穗山羊草Y258(U基因组供体)DNA将其进一步定位到U和M基因组上。扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的TaqPCRMix，2μl的ddH2O；PCR扩增程序为：(1)94℃变性4m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种欧山羊草特异分子标记获取方法，其特征在于：/n包括以下步骤/nA提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序；/nB序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选；/nC测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记；筛选得到的欧山羊草(U和M基因组)引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上。/nD以小麦属植物基因组DNA为阴性对照，欧山羊草基因组DNA为阳性对照，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。/n

【技术特征摘要】
1.一种欧山羊草特异分子标记获取方法，其特征在于：
包括以下步骤
A提取待测欧山羊草的基因组DNA后简化基因组文库构建及高通量测序；
B序列分析以及特定基因的SLAF标签的筛选；
C测序获得的SLAF标签与已知小麦的参考基因组序列进行比对后，筛选同源性小于50％的序列进行引物设计，筛选欧山羊草特异分子标记；筛选得到的欧山羊草(U和M基因组)引物进一步利用同源性山羊草中具有特定基因的山羊草基因组供体进一步定位到欧山羊草中特定基因上。
D以小麦属植物基因组DNA为阴性对照，欧山羊草基因组DNA为阳性对照，对设计的引物进行PCR扩增后获得的欧山羊草特异分子标记。


2.根据权利要求1所述的欧山羊草特异分子标记获取方法，其特征在于，所述扩增体系为10μl，包括：1μl的DNA模板，1μl的上游引物，1μl的下游引物，5μl的TaqPCRMix，2μl的ddH2O。


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【专利技术属性】
技术研发人员：宋利强，李俊明，纪军，张玮，张娜，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心，
类型：发明
国别省市：河北;13