【技术实现步骤摘要】
活体采集牛卵母细胞进行体外受精和胚胎培养的方法
本专利技术属于动物繁殖
,涉及一种用于农业-畜牧兽医繁殖的技术,具体涉及一种牛体外受精胚胎培养的方法,另外,本专利技术还涉及牛体外受精胚胎培养的相关培养液在牛体外受精胚胎培养中的应用。进一步的,本专利技术还涉及使用该牛体外受精胚胎培养的相关培养液进行牛体外受精胚胎培养的方法。特别是,本专利技术牛体外受精胚胎培养的方法具有优异的技术效果。特别是,本专利技术涉及一种从牛进行活体集体卵母细胞进而进行体外受精以及胚胎培养的方法。
技术介绍
体外受精(InVitroFertilization)或(externalfertilization)是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术,英文简称为IVF。由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分,又简称为IVF-ET。在生物学中,把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物(test-tubeanimal)。这项技术成功于20世纪50年代,在最近20年发展迅速,现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术。体外受精技术对动物生殖机理研究、畜牧生产、医学和濒危动物保护等具有重要意义。如用小鼠、大鼠或家兔等作实验材料,体外受精技术可用于研究哺乳动物配子发生、受精和胚胎早期发育机理。在家畜品种改良中,体外受精技术为胚胎生产提供了廉价而高效的手段,对充分利用优良品种资源,缩短家畜繁殖周期,加快品种改良速度等有重要价值。在人类,IVF-ET技术是治疗某些不孕症和克服性连锁病的重要措施之一。体外受精技术还是 ...
【技术保护点】
1.牛体外受精胚胎培养的方法,其包括如下步骤:/n(1)卵母细胞的采集和体外成熟/na)活体采集:取牛活体采卵来源的卵泡液,在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室;/nb)将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次,再转移到新的成熟培养液中培养22-24h,培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度;/n(2)体外受精/n将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次,再转移到受精培养液中,放入培养箱中,备用;/n从液氮中取一支冻精细管,37℃水浴解冻;无菌操作剪开细管两端,使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中,328×g离心2次,每次5min,离心后弃上清;将300μL精液制备培养液加入上述离心管,重悬精子沉淀,取适当的精子悬液进行精子计数;/n将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中,并将培养盘放入培养箱,使精卵共孵育16-20h,培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度;/n(3)胚胎体外培养及保存 ...
【技术特征摘要】
1.牛体外受精胚胎培养的方法,其包括如下步骤:
(1)卵母细胞的采集和体外成熟
a)活体采集:取牛活体采卵来源的卵泡液,在体视显微镜下捡出至少含3层卵丘细胞包裹的卵丘-卵母细胞复合体(COCs),放入包含HEPES的运输培养液中38.8℃、无二氧化碳供应、24h内运回实验室;
b)将以上离体采集或者活体采集所得COCs在卵母细胞成熟培养液中洗涤1次,再转移到新的成熟培养液中培养22-24h,培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度;
(2)体外受精
将成熟的COCs在受精培养液中洗涤1次,再转移到受精培养液中,放入培养箱中,备用;
从液氮中取一支冻精细管,37℃水浴解冻;无菌操作剪开细管两端,使精液注入盛有精液制备培养液的15mL离心管中,328×g离心2次,每次5min,离心后弃上清;将300μL精液制备培养液加入上述离心管,重悬精子沉淀,取适当的精子悬液进行精子计数;
将计算好体积的精子悬液加入盛有卵母细胞的受精培养液滴中,并将培养盘放入培养箱,使精卵共孵育16-20h,培养条件为38.8℃、5.5-6.5%CO2、饱和湿度;
(3)胚胎体外培养及保存
体外受精操作完毕后,将胚胎周围的颗粒细胞用剥卵针去除干净,放入胚胎培养液中培养,此时记为胚胎培养的第1天,培养条件为38.8℃、6%O2、88%N2、饱和湿度,第3天记录卵裂率;第7天记录囊胚率,至第9天时统计囊胚孵化率(其为孵化囊胚数除以囊胚数所得百分数),并进行质量鉴定;
将可用胚胎在保存液中洗涤3次,在平衡液中平衡10min后转移入冷冻液,按5段装液法装入胚胎,做好标记,再放入程序降温仪中按照0.5℃/min的速度降至-35℃后,将胚胎细管迅速取出,置入液氮中冷冻保存。
2.根据权利要求1的方法,其中步骤(1)之(b)中,所述成熟培养液是添加了100mL/LFBS、10μg/mLFSH、10μg/mLLH、1μg/mLE2、20ng/mLEGF的BY基础培养液。
3.根据权利要求1的方法,其中步骤(1)之(a)中,所述运输培养液中包含:甘氨酸50.0mg/L、L-丙氨酸25.0mg/L、L-精氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-天冬氨酸30.0mg/L、L-胱氨酸二盐酸盐26.0mg/L、L-谷氨酸75.0mg/L、L-谷氨酰胺100.0mg/L、L-组氨酸盐酸盐一水合物21.88mg/L、L-羟基脯氨酸10.0mg/L、L-异亮氨酸40.0mg/L、L-亮氨酸60.0mg/L、L-赖氨酸盐酸盐70.0mg/L、L-甲硫氨酸15.0mg/L、L-苯丙氨酸25.0mg/L、L-脯氨酸40.0mg/L、L-丝氨酸25.0mg/L、L-苏氨酸30.0mg/L、L-色氨酸10.0mg/L、L-酪氨酸二钠盐二水合物58.0mg/L、L-缬氨酸25.0mg/L、抗坏血酸0.05mg/L、生物素0.01mg/L、氯化胆碱0.5mg/L、D-泛酸钙0.01mg/L、叶酸0.01mg/L、甲萘醌0.01mg/L、烟酰胺0.025mg/L、烟酸0.025mg/L、对氨基苯甲酸0.05mg/L、盐酸吡哆醛0.025mg/L、盐酸吡哆醇0.025mg/L、核黄素0.01mg/L、盐酸硫胺素0.01mg/L、维生素A醋酸酯0.1mg/L、维生素D2即骨化醇0.1mg/L、α-生育酚磷酸钠盐0.01mg/L、肌醇0.05mg/L、无水氯化钙200.0mg/L、硝酸铁九水合物0.7mg/L、无水硫酸镁97.67mg/L、氯化钾400.0mg/L、氯化钠6800.0mg/L、磷酸二氢钠一水合物140.0mg/L、硫酸腺嘌呤10.0mg/L、5'-磷酸腺苷0.2mg/L、三磷酸腺苷1.0mg/L、胆固醇0.2mg/L、葡萄糖1000.0mg/L、脱氧核糖0.5mg/L、还原型谷胱甘肽0.05mg/L、盐酸鸟嘌呤0.3mg/L、次黄嘌呤钠0.354mg/L、酚红20.0mg/L、核糖0.5mg/L、醋酸钠50.0mg/L、胸腺嘧啶0.3mg/L、吐温80为20.0mg/L、尿嘧啶0.3mg/L、黄嘌呤钠0.3mg/L,以及0.01IU/mL的FSH、0.01IU/mL的LH、1μg/mL的E2,50ng/mL的EGF、100ng/mL的IGF、10%庆大霉素、55μg/mL丙酮酸钠、1.2mM/L半胱氨酸、3mg/mL的BSA、10mM/L的HEPES。
4.根据权利要求1的方法,其中HEPES即4-羟乙基哌嗪乙磺酸在所述成熟培养液中的浓度为5~15mmol/L,例如10mmol/L;或者,步骤(1)中,所述运输培养液中还包含牛磺酸和葡萄糖酸锌;或者,步骤(1)中,所述运输培养液中牛磺酸的浓度为30~50mg/L,例如40mg/L或45mg/L;或者,步骤(1)中,所述运输培养液中葡萄糖酸锌的浓度为1~3mg/L,例如2mg/L。
5.根据权利要求1的方法,其中步骤(2)中,所述受精培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液;或者
步骤(2)中,所述精液制备培养液是包含112.0mM氯化钠、4.02mM氯化钾、2.25mM的氯化钙二水合物、0.52mM六水氯化镁、0.83mM磷酸二氢钾、37.0mM碳酸氢钠、1.25mM丙酮酸钠、10μg/ml肝素、4mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、10mM咖啡因、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的水溶液。
6.根据权利要求1的方法,其中步骤(3)中,所述胚胎培养液包含:109.5mM氯化钠、3.1mM氯化钾、26.2mM碳酸氢钠、0.8mM六水氯化镁、1.19mM磷酸二氢钾、0.4mM丙酮酸钠、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸钙、2.5v/v%胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必须氨基酸、3mM的谷胱甘肽、枸橼酸钠0.04w/v%、麦芽糖0.02w/v%的水溶液;所述必需氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加:L-盐酸精氨酸6.32g、L-胱氨酸二盐酸盐1.564g、L-盐酸组氨酸一水物2.1g、L-异亮氨酸2.625g、L-亮氨酸2.62g、L-赖氨酸盐酸盐3.625g、L-蛋氨酸0.755g、L-苯丙氨酸1.65g、L-苏氨酸2.38g、L-色氨酸0.51g、L-酪氨酸1.8g和L-缬氨酸2.34g,所述非必须氨基酸为以下氨基酸按重量比例添加:L-丙氨酸0.89g、L-天门冬酰胺一水物1.5g、L-天冬氨酸1.33g、L-谷氨酸1.47g、甘氨酸0.75g、L-脯氨酸1.15g和L-丝氨酸1.05g。
7.根据权利要求1的方法,其中步骤(1)中,所述BY基础培养液是包含如下组分的水溶液:氯化钙180~220mg/L、九水硝酸铁0.70~0.75mg/L、氯化钾380~420mg/L...
【专利技术属性】
技术研发人员:王娜,王小武,赵明礼,郝少强,郭晶,张月桥,郭春明,
申请(专利权)人:天津博裕力牧科技有限公司,
类型:发明
国别省市:天津;12
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