一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法，属于分子生物学技术领域，该装置包括控压冲洗装置、负压装置和收集装置，通过控压冲洗装置控制冲洗出水水压，通过负压管路将冲洗管路冲洗基质产生的混悬液收集至收集装置，本发明专利技术同时公开了DNA的提取方法，在加压下冲洗基质，配合负压装置收集样品，克服了现有技术针对附着在基质上的微生物样品存在取样困难、取样不完整的难题，显著改善了基质附着微生物基因组DNA的代表性、提取效率和质量，条带明亮清晰、基本无降解，对难提取微生物，如真菌等均有较好的提取效率。

A device and method for extracting total DNA of substrate attached microorganism

【技术实现步骤摘要】
一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种提取基质附着微生物总DNA的装置和方法。
技术介绍
近年来，随着测序技术的发展，基于环境样品总脱氧核糖核酸(DNA)，对微生物多样性和功能进行分析的分子生物学方法不断完善，其中包括对某一特定基因的荧光定量核酸扩增检测(qPCR)法，对环境中微生物的总DNA进行测序的宏基因组技术等，逐步得到了广泛地应用。宏基因组技术被公认为是目前研究环境微生物群落结构和功能基因最全面、准确的方法，因为它没有特殊的选择性(例如纯培养/富集)，同时也减小了测序技术的偏好性(例如16SrRNA或iTS基因的PCR扩增步骤)。但是，以上这些技术的成功应用都需基于完善的DNA提取和纯化等预处理技术。在自然环境当中，各类微生物(细菌、真菌、放线菌等)往往附着于泥沙、岩石等固体表面上，形成一层致密而薄的细胞层，微生物在其基础上不断生长和繁殖，包埋在由浓稠的胞外化合物所组成的基质中，构成一个功能和结构的整体，称之为生物膜，并依托生物膜进行生长、发育和增殖等生命活动。生物膜并不是均一不变的生物结构，绝大多数生物膜内部被形成的孔隙分隔，物质在生物膜内的传质阻力随着生物膜厚度的增长也不断增加，导致了生物膜出现分层。研究表明，异养生物膜内密度随厚度的变化而不断变化，从膜表面到底部生物膜密度逐渐提高，研究人员对一种处理生活污水的生物转盘反应器的生物膜内研究，发现了大量蜂窝状结构，膜内密布着10微米左右的微孔和20～200微米的大孔，膜内孔隙率沿膜厚方向逐渐变化，膜底部的孔隙率(～30％)远低于表面(～90％)。这些结果表明底层生物膜较表层更为致密，微生物间联系更为紧密，但是，由于现有DNA提取技术未针对生物膜各层间的采样一致性进行优化，特别是对于生长在多孔基质的生物膜或生物膜的底层微生物深嵌于基质中时，所取得的样品往往只包括其中易获得的表层或部分层的微生物菌群，而不包括基质孔内或嵌入于基质中的微生物群落，从而导致取样的典型性和代表性变差，如，在热泉的硫质喷气孔附近等极度酸性条件下生存的古菌或细菌等微生物群落，随生物膜生长扩大，其基质不断被侵蚀，底层微生物也不断向内生长，这些底层微生物群落在硫代谢中也起到了极为重要的作用，因此不能忽视。如果DNA提取方法仅针对表层微生物，很可能忽略这部分微生物的信息，从而造成微生物群落结构分析的失真和宏基因组分析的失准；此外，对于真菌，其可通过大量可分枝的丝状体，即菌丝(hypha)，形成菌落(colony)或菌索(rhizomorph)组织结构，在基质上生长、附着、蔓延，以进行生命活动，造成对环境中真菌样品进行DNA提取时很难自其生长基质上剥离菌丝体，导致提取产率低、质量差，代表性更加难以保证，造成上机测序获得的结果不准确或不全面等问题。目前很多研究者采取了不同的方法预处理基质附着的微生物群落，使其满足总DNA提取的需要。这些方法主要可分为两类，一种是在微生物生长的原始位置，通过依次添加不同的试剂，对总DNA进行提取的原位提取法，例如，研究者对透析膜法培养的真菌选择将含菌丝的透析膜移至液氮预冷的研钵中直接研磨至粉末状，然后用Takara植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA；针对土壤中的微生物样品，通常的提取方法为直接将土壤样品加入提取溶剂中，用高盐溶液溶胀破裂、玻璃珠物理破碎或冻融法破裂，配合溶菌酶作用的方法使微生物细胞膜/壁破裂后，再进行DNA的提取。另一种是先应用试剂将微生物群落整体从附着基质上脱离下来，然后进行提取的异位提取法，例如，在《AneffectivemethodofDNAextractionforbioleachingbacteriafromacidminedrainage》中，Zeng等人总结提取酸性矿井废水(pH＝4.0)微生物基因组核糖核酸的方法为首先用PBS溶液通过震荡摇晃沉积物样品，使微生物自沉积物固相自发转移到液相中，然后将收集的菌体置于含有SDS和CTAB的提取缓冲溶液中，先后在沸腾水浴、60±5℃和72℃中孵育，最后用苯酚/氯仿/乙醇和冰乙醇进行核酸抽提与沉淀；吴渊虬用干棉签吸取适量去离子水，在透明胶带留有指印痕迹的一面来回擦拭一次，再取第二根干棉签擦拭透明胶带同一表面，将两根棉签一同用超敏DNA提取试剂盒按步骤提取，先用裂解液裂解转移到棉签上的细胞，然后用硅珠吸附DNA后经清洗去除杂质后，洗脱收集总DNA。虽然已经有上述已开发的各种针对不同研究者使用的提取方法，但是这些方法在针对环境中基质附着微生物的DNA提取时，均有各自的缺陷，如原位提取法中，液氮法研磨操作费时费力，需准备多个研钵，研磨后的器具不易完全清洗干净，导致提取后易污染后续样品，且在提取过程中需小心操作，不能震摇以避免DNA降解；而其他几种原位提取技术，一是需要将基质的小块完全浸没于提取液中，必须破坏基质表面，二是基质本身极易引入杂质，且提取液中普遍加入溶菌酶，导致微生物的细胞壁/膜破裂，细胞中的生物大分子大量溶出后，与基质中存在的腐殖酸、胞外蛋白、多糖、脂质、重金属等杂质发生络合等作用，导致该方法提取的DNA往往需要繁琐的后处理步骤，造成DNA提取效率的下降，甚至提取过程中的DNA大量降解，进而导致低丰度微生物的DNA损失至检测限之下，造成结果的代表性变差；而异位提取法中，由于震荡摇晃的机械力较小，或是由于棉签难以深入多孔基质的孔内部，往往转移下的微生物均为生物膜外层，难以将与基质紧密结合的微生物从基质上震荡或刮取下来，导致微生物的代表性极差。尚未有一种通用的快速、高效的自附着基质上获得具有代表性和典型性的微生物，并提取DNA的方法。基于现有技术的缺陷，亟需专利技术一种新的快速、高效、易操作的自附着基质上获得微生物的装置和方法，从而保证取样的典型性和代表性。
技术实现思路
1、目标解决的问题针对生物膜往往由多层组成，各层间的微生物组成存在较大的差异，现有微生物采样技术很难通过一次取样，快速获得各层的均一性样品，特别是当生物膜的生长基于多孔或生物膜的底层微生物深嵌于基质中时，所取得的样品往往只包括其中易获得的表层或部分层的微生物菌群，而不包括基质孔内或嵌入于基质中的微生物群落，从而导致取样的典型性和代表性变差等问题，本专利技术提供了一种通用的快速、高效、易操作的自附着基质上获得微生物的装置和方法，从而保证取样的典型性和代表性。2、技术方案为解决上述问题，本专利技术采用如下的技术方案。本专利技术提供了一种提取基质附着微生物总DNA的装置，包括控压冲洗装置、负压装置和收集装置，所述控压冲洗装置的出液端口处设有冲洗管路，所述收集装置分别与负压管路和负压泵相连通，所述的收集装置与负压泵相连通，所述的控压冲洗装置用于控制冲洗管路出水水压，所述的负压管路通过负压泵将冲洗管路冲洗微生物附着基质产生的液体抽吸至收集装置。所述的控压冲洗装置安装在缓冲液容器下部，可以精确控制的出水水压(至少5级可调)，如维持出水压强0.5～100Mpa。所述冲洗管路可以控制冲洗液和基质接触位点的面积在需要取样的生物膜面积的2±0.2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：包括控压冲洗装置(2)、负压装置和收集装置(8)，所述控压冲洗装置(2)的出液端口处设有冲洗管路(3)，所述的负压装置包括负压管路和负压泵(9)，所述收集装置(8)分别与负压管路和负压泵(9)相连通，所述的控压冲洗装置(2)用于控制冲洗管路(3)出水水压，所述的负压管路通过负压泵(9)将冲洗管路(3)冲洗微生物附着基质(4)产生的液体抽吸至收集装置(8)。/n

【技术特征摘要】
1.一种提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：包括控压冲洗装置(2)、负压装置和收集装置(8)，所述控压冲洗装置(2)的出液端口处设有冲洗管路(3)，所述的负压装置包括负压管路和负压泵(9)，所述收集装置(8)分别与负压管路和负压泵(9)相连通，所述的控压冲洗装置(2)用于控制冲洗管路(3)出水水压，所述的负压管路通过负压泵(9)将冲洗管路(3)冲洗微生物附着基质(4)产生的液体抽吸至收集装置(8)。


2.根据权利要求1所述的提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：所述负压泵(9)为防水泵，所述负压管路包括第一负压管路(5)和第二负压管路(6)，所述第一负压管路(5)的一端与控压冲洗装置(2)密封连接，其另一端设置为开放端；所述冲洗管路(3)嵌套在第一负压管路(5)内部，且所述冲洗管路(3)的出水端位于第一负压管路(5)开放端的上部；所述第一负压管路(5)上设置开口并通过所述开口与第二负压管路(6)相连通，所述的第二负压管路(6)与收集装置(8)相连通。


3.根据权利要求2所述的提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：所述装置还包括杂质脱除装置(7)，所述的杂质脱除装置(7)分别与第二负压管路(6)和收集装置(8)相连通，所述杂质脱除装置(7)用于去除较大的固体颗粒。


4.根据权利要求3所述的提取基质附着微生物总DNA的装置，其特征在于：所述开放端可连接不同形状的端口以适应不同实际情况的采样需要，所述的冲洗管路(3)可控制冲洗液散射直径为(1～3)±0.3mm。


5.一种提取基质附着微生物总DNA的方法，其特征在于：所述方法利用权利要求1～4任意一项所述的提取基质附着微生物总DNA的装置进行DNA提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：李侃，任鑫坤，张徐祥，许柯，王庆，张志超，
申请(专利权)人：南京大学，南京大学宜兴环保研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32