小鼠乳房炎模型的构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。本发明专利技术采用乳导管注射大肠杆菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。本发明专利技术利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的乳房炎预防和治疗以及血乳屏障损伤修复的研究等相关领域，为奶牛乳房炎防治的相关研究提供合适的实验动物模型。

Construction method and application of mouse mastitis model

【技术实现步骤摘要】
小鼠乳房炎模型的构建方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。
技术介绍
乳房炎是哺乳动物常见的一种危害较大的临床性疾病，是奶牛乳腺薄壁组织受病原微生物、物理或者化学等致病因素刺激所导致的一种潜在致命性炎症反应。它发病率高、流行快、造成的经济损失巨大。据统计，我国奶牛乳房炎发病率在60％～70％，美国接近40％。全球每年因奶牛乳房炎所导致的产奶量下降、废弃奶产生、患病牛治疗和淘汰等经济损失高达350亿美元。研究证明，大肠杆菌是诱发奶牛临床性乳房炎的主要环境性致病菌，通常引发急性或超急性乳房炎，临床症状明显。JorenVerbeke等人在2014年对845份奶牛乳房炎样品进行检测分析发现，在一级、二级、三级乳房炎中，大肠杆菌的分离百分比分别为45.8％、36.6％和17.6％。由大肠杆菌导致的急性乳房炎早期会扰乱其乳腺上皮细胞正常分泌乳汁的功能，导致乳汁中断，还会使血乳屏障发生变化，而屏障功能被破坏后，乳汁中的成分如α-乳清蛋白和酪蛋白会进入血液，血液中的成分也会进入乳汁，严重者形成血乳，导致弃乳。血乳屏障功能的实现依赖于乳腺上皮细胞的完整性和细胞间的连接复合体实现，包括紧密连接(Tightjunction，TJ)、粘附连接(Adhesionjunction，AJ)和桥粒(Desmosome)。其中紧密连接是血乳屏障的重要组成部分，位于上皮细胞最顶端的连接复合物，呈连续的带状结构，将相邻的上皮细胞互相连接。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法及应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种小鼠乳房炎模型的构建方法，采用乳导管注射大肠杆菌悬液的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。所述方法包括：在体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后使用微型注射器微型注射器经乳导管给哺乳期小鼠乳腺注射大肠杆菌悬液，然后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养8～15h(优选12h)。优选地，哺乳期小鼠是指产后7～15天(优选8天)的母鼠。优选地，所述大肠杆菌的菌株编号为ATCC25922。优选地，所述大肠杆菌悬液的浓度为2×103～2×105CFU/mL(优选2×104CFU/mL)，用PBS溶液进行配制。每只小鼠注射40～100μL(优选50μL)大肠杆菌悬液。优选地，所述小鼠为CD-1小鼠。第二方面，本专利技术提供按照上述方法获得的小鼠乳房炎模型在大肠杆菌诱发的乳房炎预防和治疗的药物筛选以及血乳屏障损伤修复的机制研究中的应用。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术采用乳导管注射活菌的方式进行小鼠乳房炎模型构建，相较于现有的小鼠乳房炎模型构建方法，本方法具有以下优点：(一)本专利技术采用在体视体视显微镜下操作，去除乳头最外侧角质层，在基本不破坏乳头的基础上进行菌液注射，更为科学。(二)本专利技术利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的血乳屏障损伤机制的研究等相关领域，为探究奶牛大肠杆菌乳房炎发病机理提供合适的实验动物模型。(三)本专利技术利用大肠杆菌构建的小鼠乳房炎模型，可广泛应用于大肠杆菌诱发的乳房炎治疗、预防相关药物的筛选与血乳屏障损伤修复的研究等相关领域，为探究奶牛大肠杆菌乳房炎的防治提供合适的实验动物模型。附图说明图1为本专利技术的技术路线图。图2为本专利技术实施例1中对照组乳腺组织病理分析结果图。图3为本专利技术实施例1中大肠杆菌处理组乳腺组织病理分析结果图。图4为本专利技术实施例1中小鼠乳腺组织病理评分示意图。图5为本专利技术实施例1中对照组乳腺组织苏木精-伊红染色切片(100×)图。图6为本专利技术实施例1中大肠杆菌处理组乳腺组织苏木精-伊红染色切片(100×)图。图7为本专利技术实施例1中小鼠乳腺组织苏木精-伊红染色切片病理评分示意图。图8为本专利技术实施例1中乳腺组织炎性因子含量示意图。图9为本专利技术实施例1中血清炎性因子含量示意图。图10为本专利技术实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白ZO-1免疫荧光染色图。图11为本专利技术实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白Claudin-3免疫荧光染色图。图12为本专利技术实施例1中血乳屏障中紧密连接蛋白Occludin免疫荧光染色图。图13为血乳屏障中紧密连接的透射电镜(TEM)示意图。其中，图4、图7-图9中**表示与对照组相比差异显著。具体实施方式本专利技术提供一种利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的方法，包括以下步骤：(1)将怀孕18天左右的CD-1小鼠随机分为对照组和大肠杆菌处理组。(2)小鼠产后8天左右移走新生小鼠，对照组和大肠杆菌处理组小鼠采用舒泰进行麻醉。在体视体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后通过微型注射器给对照组乳导管注射50μLPBS无菌溶液，大肠杆菌处理组注射50μL2×104CFU/mL(103CFU)的大肠杆菌悬液(用无菌PBS溶液进行配制)。(3)试验处理后12h采用断颈法处死小鼠，取其乳腺组织样品和血液样品。(4)将取得的乳腺组织用生理盐水清洗后，用4％的甲醛溶液固定，经乙醇脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，观察其组织病理形态变化。(5)称取乳腺组织0.2g，加入2000μLRAPI组织细胞裂解液，用玻璃匀浆器制备匀浆，12000rpm离心10min，收集上清液进行ELISA分析，检测样品中的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β。(6)所得血液样品经12000rpm离心10min，收集上清液进行ELISA分析，检测样品中的炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β。进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(1)中，对照组小鼠5只，大肠杆菌处理组5只。进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(2)中，麻醉小鼠采用舒泰(50mg/mL)肌肉注射的方式，给药量为50μL。进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(2)中，所用的大肠杆菌菌株为ATCC25922。进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(3)中，乳腺组织的取样方法为：处死小鼠后，沿腹中线剪开皮肤(不剪破腹膜)，暴露试验乳区，钝性分离乳腺组织。进一步地，如上述的利用大肠杆菌构建小鼠乳房炎模型的建立方法，步骤(3)中，小鼠血液样品的采集方法为眼球采血法。本专利技术的技术路线图见图1。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1小鼠乳房炎模型的构建本专利技术所用大肠杆菌菌株为ATCC25922，由北京中源合聚生物科技有限公司提供；试验小鼠由斯贝福(北京)实验动物科技有限公司提供；炎性因子ELIS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.小鼠乳房炎模型的构建方法，其特征在于，将大肠杆菌悬液采用微型注射器经乳导管注射的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。/n

【技术特征摘要】
1.小鼠乳房炎模型的构建方法，其特征在于，将大肠杆菌悬液采用微型注射器经乳导管注射的方式进行小鼠乳房炎模型的构建。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：在体视体视显微镜下，去除乳头最外侧角质层，然后通过微型注射器给哺乳期小鼠乳导管注射大肠杆菌悬液，然后使小鼠自由采食，充足饮水，饲养8～15h。


3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，哺乳期小鼠是指产后7～15天的母鼠。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌的菌株编号为AT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李胜利，郑宇慧，刘钢，王蔚，曹志军，杨红建，王雅晶，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11