一种建立基于CRISPR的基因敲减肺癌细胞株的方法及细胞株技术

本发明专利技术公开了一种肺癌细胞株的基因编辑方法。本发明专利技术基于CRISPR/Cas 9技术进行改良，通过构建表达效率更佳的重组质粒，建立一种稳定敲减肺癌基因细胞株的方法。所需shRNA通过引物合成的方式可以保证精准获得，退火后作为插入片段装入改造过的CRISPR载体中，构建成用于敲减的shRNA重组质粒。经包装慢病毒后与肺癌细胞共孵育，通过慢病毒介导将shRNA导入肺癌细胞中，对基因编辑后的肺癌细胞进行嘌呤霉素(Puromycin)抗性筛选同时进行单克隆化培养，最终获得基因敲减阳性的稳定肺癌细胞株。本方法为研究基因在肺癌发生发展中的分子机理提供了新的实验材料，对肺癌的相关建模提供参考。

A method and cell line of gene knockdown lung cancer based on CRISPR

【技术实现步骤摘要】
一种建立基于CRISPR的基因敲减肺癌细胞株的方法及细胞株
本专利技术涉及肺癌研究领域中的肿瘤细胞基因编辑范畴，具体来说，本专利技术涉及一种肺癌细胞株的基因编辑方法。
技术介绍
肺癌连续十年位居中国恶性肿瘤死亡率和发病率的榜首，俨然成为我国“第一癌”。在全世界范围内，肺癌的发病率也呈现持续上升趋势，吸烟、汽车尾气、空气污染、厨房油烟、职业粉尘等，共同促使肺癌成为“第一癌”。肺癌是一种基因异常疾病，在癌细胞中形成了数百或数千的突变，了解基因突变致癌的机理以及调控肺癌发生发展过程的重要基因功能，是肺癌研究的一个重大挑战。通常需要建立细胞模型将目标基因的表达做干扰处理，体外探讨相关基因干扰表达后的变化，从而了解该基因的功能。基因干扰和基因敲减均为研究基因生物学功能的重要技术，两者各有所长。shRNA是shorthairpinRNA的缩写，即“短发夹RNA”，是一段具有紧密发夹环的RNA序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子调控。随后再连上5-6个T本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种建立基于CRISPR的基因敲减肺癌细胞株的方法，其特征在于：以肺癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导shRNA实现编辑肺癌细胞基因的目的，包括以下步骤：/n1)shRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，找到基因起始密码子处的序列或剪接体共有的外显子区域为靶位点，选取靶位点序列设计shRNA，或根据shRNA在线设计软件选取shRNA，或也可以参考现有技术中(已发表论文中)验证过的有效shRNA序列；/n2)shRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将两条短反向重复序列即shRNA序列按镜像方向排列，中间用茎环(loop)序列间隔，作为插入片...

【技术特征摘要】
1.一种建立基于CRISPR的基因敲减肺癌细胞株的方法，其特征在于：以肺癌细胞作为靶细胞，利用慢病毒介导shRNA实现编辑肺癌细胞基因的目的，包括以下步骤：
1)shRNA的设计及选取：确定物种(如人或鼠)及要编辑的目标基因序列，对基因序列的结构进行解析，找到基因起始密码子处的序列或剪接体共有的外显子区域为靶位点，选取靶位点序列设计shRNA，或根据shRNA在线设计软件选取shRNA，或也可以参考现有技术中(已发表论文中)验证过的有效shRNA序列；
2)shRNA的制备及重组慢病毒质粒的构建：将两条短反向重复序列即shRNA序列按镜像方向排列，中间用茎环(loop)序列间隔，作为插入片段克隆至用BmsbI酶酶切好的去掉Cas9序列的LentiCRISPRV2载体中，获得重组shRNA质粒；
3)对阳性重组质粒进行测序鉴定：将所得重组质粒转化到感受态Stbl3菌株中，过夜培养，挑取单菌落，氨苄青霉素抗性LB培养基摇12-16小时；提取质粒，用BsmbI(或同工酶ESP3I酶)酶切鉴定，切下小于2000bp的片段表示有目的片段插入，后续将质粒用引物对：LentiV25：CTTGGGTAGTTTGCAGTTTTA和LentiV23：CTCCTTTCAAGACCTAGCTAG利用PCR扩增，再次扩增获得小于2000bp的条带，该PCR产物样品可以测序确认shRNA的序列(测序引物建议使用LentiV23)，测序序列中必须找到目的shRNA序列及茎环(loop)序列；测序正确的重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：朴海龙，李同明，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21