一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用技术

本发明专利技术涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，该制备方法包括：S1，pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL慢病毒质粒载体的构建；S2，用pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；S3，K562‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL滋养细胞的制备；S4，获取脐血的白膜层细胞；S5，脐血γδT细胞的体外扩增。本发明专利技术的制备方法利用okt3单链抗体通过CD8A跨膜区表达在滋养细胞膜上，尤其是能从脐血中低成本、快速、大量扩增γδT细胞，经过一个24天的扩增周期，γδT细胞的扩增倍数能达到10000倍左右，制备的γδT细胞纯度能达到90％以上。相较于用可溶的okt3抗体刺激，膜结合的okt3对γδT细胞扩增倍数在其2倍以上，具有良好的临床应用前景。

A kind of trophoblast, its preparation method and its application in the rapid expansion of a large number of \u03b3 \u03b4 T cells

【技术实现步骤摘要】
一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用
本专利技术涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用。
技术介绍
根据T细胞受体，T细胞能分为两种，即αβT细胞和γδT细胞。在健康成人当中，γδT细胞在外周血中占T细胞的比例为3％到5％左右，而其中50％到75％是Vγ9Vδ2T细胞，而在脐血中，γδT细胞的含量更低，可能只有外周血的十分之一，因而在体外大量扩增脐血γδT细胞比较困难。γδT细胞介导的是一种先天性免疫，它不需要MHC分子的抗原提呈，在免疫监视和防范肿瘤发生起着重要的作用。它已经被发现浸润在肾癌、卵巢癌以及直肠癌等各种人类癌症组织中，它们能识别由转化细胞表达的压力相关抗原，发挥即刻的细胞毒作用以及分泌IFN和TNF等细胞因子。有文献都报道从肿瘤组织或外周血中分离的γδT细胞在体外对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。另外，γδT细胞还能提呈抗原给CD8和CD4T细胞，从而引发过继性抗肿瘤反应。Vγ9Vδ2T细胞能被磷酸化抗原IPP或者它的类似物BrHPP激活并增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ ID NO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。/n

【技术特征摘要】
1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQIDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。


2.一种权利要求1所述的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11,利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；
S12,将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL。


3.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10wt％FBS的1640；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。


4.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。


5.一种γδT细胞的制备方法，特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδT细胞。


6.如权利要求5所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδT细胞为脐血γδT细胞或外周血γδT细胞。


7.如权利要求5或6所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：
S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；
S4，获取脐血的白膜层细胞；
S5，脐血γδT细胞的体外扩增。


8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。


9.如权利要求8所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，
步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.0-4.5million的293FT细胞和8-9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：450-500μLjetPRIMEbuffer、5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云龙，
申请(专利权)人：秦皇岛中邦干细胞医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13