一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用技术

本发明专利技术涉及一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，该制备方法包括：S1，pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL慢病毒质粒载体的构建；S2，用pLenti‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；S3，K562‑okt3‑CD64‑CD86‑4.1BBL滋养细胞的制备；S4，获取脐血的白膜层细胞；S5，脐血γδT细胞的体外扩增。本发明专利技术的制备方法利用okt3单链抗体通过CD8A跨膜区表达在滋养细胞膜上，尤其是能从脐血中低成本、快速、大量扩增γδT细胞，经过一个24天的扩增周期，γδT细胞的扩增倍数能达到10000倍左右，制备的γδT细胞纯度能达到90％以上。相较于用可溶的okt3抗体刺激，膜结合的okt3对γδT细胞扩增倍数在其2倍以上，具有良好的临床应用前景。

A kind of trophoblast, its preparation method and its application in the rapid expansion of a large number of \u03b3 \u03b4 T cells

【技术实现步骤摘要】
一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用
本专利技术涉及基因工程和细胞生物学领域，具体涉及到一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用。
技术介绍
根据T细胞受体，T细胞能分为两种，即αβT细胞和γδT细胞。在健康成人当中，γδT细胞在外周血中占T细胞的比例为3％到5％左右，而其中50％到75％是Vγ9Vδ2T细胞，而在脐血中，γδT细胞的含量更低，可能只有外周血的十分之一，因而在体外大量扩增脐血γδT细胞比较困难。γδT细胞介导的是一种先天性免疫，它不需要MHC分子的抗原提呈，在免疫监视和防范肿瘤发生起着重要的作用。它已经被发现浸润在肾癌、卵巢癌以及直肠癌等各种人类癌症组织中，它们能识别由转化细胞表达的压力相关抗原，发挥即刻的细胞毒作用以及分泌IFN和TNF等细胞因子。有文献都报道从肿瘤组织或外周血中分离的γδT细胞在体外对肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。另外，γδT细胞还能提呈抗原给CD8和CD4T细胞，从而引发过继性抗肿瘤反应。Vγ9Vδ2T细胞能被磷酸化抗原IPP或者它的类似物BrHPP激活并增殖。K562细胞为一种人慢性骨髓性白血病细胞系，经常通过基因修饰来作为抗原提呈细胞来支持免疫细胞的扩增。还有文献报道了通过表达膜结合的IL15和CD86以及CD137L的K562细胞来扩增外周血中的γδT细胞。近年来，越来越多体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞被用于临床治疗，还有文献报道了对10名癌症患者进行了多轮Vγ9Vδ2T细胞回输治疗，结果6名患者获得了SD(疾病稳定)。还有文献报道了用体外扩增的Vγ9Vδ2T细胞对一个晚期肝胆管癌的患者做了8个疗程的治疗，结果发现经过治疗后，患者的淋巴结肿瘤转移灶明显缩小，肿瘤标志物表达水平明显降低，整个治疗过程中没有发现明显的毒负作用。因而Vγ9Vδ2T细胞有着良好的临床应用前景。由于Vγ9Vδ2T细胞在脐血中的含量非常低，再加上来源于脐血的γδT细胞免疫原性很低，目前还没有文献报道一种可行的大规模扩增脐血γδT细胞的方法。因而，目前亟需一种能够低成本快速大规模的扩增方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种滋养细胞、其制备方法及其在大量快速扩增γδT细胞中的应用，可提高脐血或外周血中Vγ9Vδ2T细胞的扩增效率，从而达到大规模生产用于临床肿瘤免疫治疗的Vγ9Vδ2T细胞的目的。本专利技术的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本专利技术提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQIDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。依据本专利技术提出的一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，包括以下步骤：S11,利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；S12,将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL；本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。依据本专利技术提出的一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，包括以下步骤：S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10％FBS的1640；S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；S33，用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存，用于以后的γδT细胞培养实验。本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。依据本专利技术提出的一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，所述滋养细胞是通过上述的方法制备得到的。本专利技术的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。依据本专利技术提出的一种γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：将上述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδT细胞。优选的，前述的γδT细胞的制备方法，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδT细胞为脐血γδT细胞或外周血γδT细胞。优选的，前述的γδT细胞的制备方法，包括以下步骤：S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；S4，获取脐血的白膜层细胞；S5，脐血γδT细胞的体外扩增。优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S2具体包括：S21，重组慢病毒的包装制备；S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.0-4.5million的293FT细胞和8-9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：450-500μLjetPRIMEbuffer、5-6μgpLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体或者pLenti-CD64-CD86-4.1BBL、3-4μgpsPAX2和1.5-1.8μgpMD2.G，混合均匀，然后再向体系中加入jetPRIME，25μL/10cm培养皿，再次混合均匀，室温静置8-10min，得到混合液；S21-3)将用于包装病毒的293FT细胞从培养箱中取出，将混合液平均加到每个培养皿中，混匀，放入培养箱中继续培养。培养4-5h后，弃去旧培养基，加入PBS清洗细胞，再加入含10wt％FBS的DMEM完全培养基，放入培养箱中进行培养。优选的，前述的γδT细胞的制备方法，步骤S22中，所述重组慢病毒的超速离心浓缩方法为：S22-1)培养48小时后收取培养上清作为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQ ID NO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。/n

【技术特征摘要】
1.一种pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体，其特征在于，所述pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体包括如SEQIDNO:5所示的整个编码区序列okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro。


2.一种权利要求1所述的pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11,利用基因合成的方法，获得okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因的全长编码区序列；
S12,将okt3-E2A-CD64-P2A-CD86-F2A-4.1BBL-T2A-Puro基因构建到慢病毒载体pLenti-mbIL21-4.1BBL上，得到质粒载体pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL。


3.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S31，将1-2million的旺盛生长的K562细胞放入24孔板中的一个孔进行培养，培养基为1毫升含有10wt％FBS的1640；
S32，再将30-35毫升病毒上清液超速离心浓缩的300μL慢病毒颗粒加入孔中，培养5-6天后，再用2-4μg/ml的Puromycin进行选择性培养；
S33，用流式检测okt3、D64、D86和4.1BBL这4个基因在K562细胞的表达，使各个基因的表达在80％以上；
S34，再用100Gy的γ射线照射10分钟，-80℃冰箱进行冻存。


4.一种K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞，其特征在于，所述滋养细胞是通过权利要求3所述的方法制备得到的。


5.一种γδT细胞的制备方法，特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的质粒载体包装慢病毒颗粒后，再将所述慢病毒颗粒侵染滋养细胞系，获得能够表达目的基因的滋养细胞，再利用滋养细胞在体外大量扩增γδT细胞。


6.如权利要求5所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，所述目的基因包括okt3、CD64、CD86和4.1BBL中的至少一种；所述滋养细胞系包括肿瘤细胞；所述γδT细胞为脐血γδT细胞或外周血γδT细胞。


7.如权利要求5或6所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL慢病毒质粒载体的构建：
S2，用pLenti-okt3-CD64-CD86-4.1BBL质粒载体包装慢病毒颗粒；
S3，K562-okt3-CD64-CD86-4.1BBL滋养细胞的制备；
S4，获取脐血的白膜层细胞；
S5，脐血γδT细胞的体外扩增。


8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤S2具体包括：
S21，重组慢病毒的包装制备；
S22，重组慢病毒的超速离心浓缩。


9.如权利要求8所述的γδT细胞的制备方法，其特征在于，
步骤S21中，所述重组慢病毒的包装制备方法为：
S21-1)每10cm细胞培养皿中加入4.0-4.5million的293FT细胞和8-9毫升DMEM完全培养基，混合混匀，在细胞培养箱中进行培养；
S21-2)培养第2天，每个培养皿中加入如下试剂：450-500μLjetPRIMEbuffer、5-...

【专利技术属性】
技术研发人员：张云龙，
申请(专利权)人：秦皇岛中邦干细胞医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13