一种TIM-3纳米抗体、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于来自动物或人的抵抗物质技术领域，公开了一种TIM‑3纳米抗体、制备方法及其应用，纳米抗体为TIM‑3纳米抗体序列为SEQ ID NO：1；TIM‑3抗原为哺乳动物细胞瞬时转染表达，使用TIM‑3抗原对纳米抗体库进行多次筛选，获得特异性的纳米抗体噬菌体，测序得到目的片段。本发明专利技术使用HEK293细胞株对抗原进行表达，使用哺乳动物表达系统表达人的蛋白最大化的保证蛋白的原始结构，保证了蛋白拥有翻译后修饰以及糖基化等真核蛋白特有的修饰，使获取的蛋白具有较高活性；该方法最大地的保证了蛋白的原始结构与活性；本发明专利技术筛选得到的纳米抗体能高效、特异性的结合到靶点上。

Tim-3 nano antibody, preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种TIM-3纳米抗体、制备方法及其应用
本专利技术属于来自动物或人的抵抗物质
，尤其涉及一种TIM-3纳米抗体、制备方法及其应用。
技术介绍
目前，T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T-cellimmunoglobulinandmucin-3，TIM-3)，是一种膜蛋白，属于T细胞免疫球蛋白家族的新成员。首次发现是在Th1型淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞中。鼠源的TIM-3编码基因存在于第11号染色体上，与人源TIM-3有很高的相似度，而人源的TIM-3编码基因存在于第5号染色体上，含有7个外显子。研究认为TIM-3只选择性的表达于激活的Th1细胞上，可以作为区分和Th2细胞的新的标志物。TIM-3通过与其配体结合能够发挥抑制Th1细胞的功能。它参与炎症的发生，能够调节免疫细胞的活化与功能，在许多疾病反应中起着非常重要的作用。在非Th1细胞上也会表达，并发挥着不同的生物学功能。当TIM-3与Bat3结合后，它的活性会被抑制。Th1特异性转录因子T-bet能调控TIM-3的表达，而且T-bet可以直接与TIM-3的启动子结合。TIM-3能够调节Th1与Th2细胞的功能，多种疾病的发生也与它的异常表达相关，因此被认为是机体疾病相关的重要基因。生物免疫治疗相对传统化疗或靶向治疗，有一个本质逻辑区别:“免疫治疗”针对的是免疫细胞(或者说是免疫系统)，而不是癌症细胞。在癌症免疫治疗中，抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一，其机制是通过抑制通路中相关靶点解除T细胞活性受抑状态，活化后的T细胞能够进攻和消灭肿瘤细胞。抗体并不直接作用于肿瘤细胞，而是通过作用于T细胞类间接杀伤肿瘤细胞；另外，它们并不是针对肿瘤表面的某种特定物质，而是系统性地增强了全身的抗肿瘤免疫反应。TIM-3靶点以及TIM-3单克隆抗体是生物免疫治疗中的一个热点。纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中首次报道，在羊驼外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体，该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块。更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD，因此也被称作纳米抗体(Nanobody，Nb)。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有的单克隆抗体由于分子质量大150ku以及鼠源等问题对人体存在异源性。小鼠的单克隆抗体，对人体的应用会产生抗鼠单克隆抗体，它不可重复应用，影响其疗效。(2)现有的单克隆抗体体积相对较大，不能较好的进入肿瘤组织；单克隆抗体开发周期长，生产成本高，产量低；单克隆抗体类药物价格昂贵，研发复杂，人源化复杂，成功率有限。(3)现有的单克隆抗体难以大规模生产，单克隆抗体药物在建厂和生产过程中消耗的资金非常巨大。(4)现有的单克隆抗体不稳定，容易降解，保存成本高；容易污染，维护成本高昂。在高温和强酸强碱的条件下会分解，须在低温下保存，否则就会在数周内完全失去活性。抗体能被消化系统很快降解，从而阻止了其进入大脑或其他有效作用部位。解决上述技术问题的难度：纳米抗体包含3个高变区与4个骨架区，高变区均在同一侧。与人类抗体的VH有着同样的结构，测序显示与VH3同源性极高，但是纳米抗体的CDR1(Complementarity-determiningregion-1)与CDR3(Complementarity-determiningregion-3)相对较长。纳米抗体的CDR3具有突出，可以增加与抗原结合的亲和力。纳米抗体具有稳定的结构，保证了结合的稳定性。噬菌体展示技术是应用普遍的一种生产纳米抗体的途径，将纳米抗体的序列导入到噬菌体序列中，目的蛋白将表达在噬菌体的外壳上，噬菌体文库构建是免疫驼科动物，取动物白细胞，将RNA进行反转录，构建对抗原有针对性地文库。解决上述技术问题的意义：中国医学科学院研制成一种具有定向性、选择性杀伤肿瘤细胞的“单抗-药物”联结物，即以单克隆抗体为“载体”，携带药物精确地和肿瘤细胞结合，能在原位杀死癌细胞，而对其他正常细胞无损伤。这种综合性药物好比是专攻癌症的“生物导弹”，人们把这种治疗方法形象地比喻为导弹疗法。而纳米抗体可以更好的进行这一功能。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种TIM-3抗原、纳米抗体及其筛选和鉴定方法、纳米抗体的应用。纳米抗体可以在严苛的环境中保持构象不变。纳米抗体抗热特别好，可以在室温下存放一周以上。而超强的耐酸碱性可以使纳米抗体更好的抵抗不同的环境，也可以增加纳米抗体的作用范围。单域重链抗体微小的体积也使它获得了较低的免疫原性。使动物长期注射蛋白成为可能。纳米抗体与抗原的结合位点也与单克隆抗体不同，并且可以结合到传统抗体结合不到的地方。纳米抗体可以使用原核表达生产，大大的降低了生产成本。本专利技术是这样实现的，一种纳米抗体，所述纳米抗体为TIM-3纳米抗体，其序列为SEQIDNO：1。本专利技术的另一目的在于提供一种表达所述纳米抗体的TIM-3抗原，所述TIM-3抗原为哺乳动物细胞瞬时转染表达，使用TIM-3抗原对纳米抗体库进行多次筛选，获得特异性的纳米抗体噬菌体，测序得到目的片段。本专利技术的另一目的在于提供一种所述纳米抗体的筛选和鉴定方法，所述纳米抗体的筛选和鉴定方法包括以下步骤：第一步，构建载体：目的片段扩增，换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆。第二步，蛋白鉴定。第三步，构建抗体库：样品总RNA提取及cDNA合成，VHH文库片段的制备，电转化和文库构建。进一步，所述第一步的目的片段扩增具体为：(1)设计合成引物2条，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物。引物的序列为：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3。(2)PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。进一步，所述第一步的PCR各个成分的用量：引物浓度为1OD溶于400ulddH2O。反应体系：50ul。引物mix，(1/28)0.4ulx13.6共8ul。10XpfuBuffer：5ul。每段上下游引物各2ul。Pfu：0.4ul(5u/ul)。ddH2O分别补水至50ul。目的片段PCR的方法扩增具体步骤为：(1)第一轮PCR程序：以上为第一轮PCR反应体系，以第一轮PCR产物为模板做第二轮PCR。(2)第二轮PCR反应体系：PCR各个成分的用量：引物浓度为1OD溶于400ulddH2O。上游引物-1：2ul、下游引物-28：2ul、第一轮pcr产物：1ul、dNTP：1ul(25mMeach)、10XpfuBuffer：5ul、Pfu：0.4ul(5u/ul)、ddH2O补齐至50ul。(3)第二轮PCR程序：以第二轮PCR琼脂糖凝胶电泳，回收纯化好的片段本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为TIM-3纳米抗体，其序列为SEQ ID NO：1。/n

【技术特征摘要】
20190705 CN 20191060423541.一种纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为TIM-3纳米抗体，其序列为SEQIDNO：1。


2.一种表达权利要求1所述纳米抗体的TIM-3抗原，其特征在于，所述TIM-3抗原为哺乳动物细胞瞬时转染表达，使用TIM-3抗原对纳米抗体库进行多次筛选，获得特异性的纳米抗体噬菌体，测序得到目的片段。


3.一种如权利要求1所述纳米抗体的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述纳米抗体的筛选和鉴定方法包括以下步骤：
第一步，构建载体：目的片段扩增，换载酶切，目的片段与载体连接，转化，筛选克隆；
第二步，蛋白鉴定；
第三步，构建抗体库：样品总RNA提取及cDNA合成，VHH文库片段的制备，电转化和文库构建。


4.如权利要求3所述的纳米抗体的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述第一步的目的片段扩增具体为：
(1)设计合成引物2条，通过PCR的方法扩增出足够量的目的产物；引物的序列为：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3；
(2)PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。


5.如权利要求3所述的纳米抗体的筛选和鉴定方法，其特征在于，所述第一步的PCR各个成分的用量：引物浓度为1OD溶于400ulddH2O；反应体系：50ul；引物mix，(1/28)0.4ulx13.6共8ul；10XpfuBuffer：5ul；每段上下游引物各2ul；Pfu：0.4ul(5u/ul)；ddH2O分别补水至50ul；
目的片段PCR的方法扩增具体步骤为：
(1)第一轮PCR程序：



以上为第一轮PCR反应体系，以第一轮PCR产物为模板做第二轮PCR；
(2)第二轮PCR反应体系：
PCR各个成分的用量：引物浓度为1OD溶于400ulddH2O；
上游引物-1：2ul、下游引物-28：2ul、第一轮pcr产物：1ul、dNTP：1ul(25mMeach)、10XpfuBuffer：5ul、Pfu：0.4ul(5u/ul)、dd...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈创夫，吴鹏，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65