人体共生菌群在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用制造技术

本公开涉及了一种健康人肠道菌群的菌液、其制备方法和质量控制。本公开还涉及一种健康人肠道菌群的菌液与免疫信号通路调节剂联合，用于治疗肿瘤患者，以提高肿瘤对免疫治疗的应答的用途。

The role of human symbiotic flora in improving the response of tumor immunotherapy

【技术实现步骤摘要】
人体共生菌群在提高肿瘤免疫治疗应答中的作用
本公开涉及生物医药领域，更具体地，它涉及使用人体肠道微生物组来提高肿瘤免疫治疗应答。
技术介绍
近年来，全球癌症患者激增，最新数据表明：2017年，全球新发癌症病例2450万，癌症死亡病例960万。结直肠癌(colorectalcancer,CRC)，又称为大肠癌、直肠癌、大肠直肠癌、结肠直肠癌、或肠癌，为源自结肠或直肠(为大肠的一部分)的癌症。因为细胞不正常的生长，可能侵犯或转移至身体其他部分，结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一。人体微生物被称为“人类的第二基因组”。肠道是人体内最大的微生态环境，参与人体的营养吸收、能量代谢、组织器官发育、免疫防御及内分泌调控等多种重要的生理过程。近十几年来肠道微生态学取得了飞跃式的发展，人类对其认识不断加深，肠道微生态被认为是人体的“第二大脑”和“第二基因组”，与人类健康息息相关。粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation,FMT)，其定义是将健康人粪便中的功能菌群，移植到患者胃肠道内，重建新的肠道菌群，实现肠道及肠道外疾病的治疗。2013年，菌群移植治疗复发性艰难梭菌感染被列入美国医学指南，并入选2013年美国时代杂志“世界十大医学突破”和美国克利夫兰医学中心“影响2014年的十大医学创新”榜单。PD-1(programmeddeath1,程序性死亡受体1)是由T细胞表达的一类免疫检查点(immunecheckpoint)分子，为CD28超家族成员。PD-1是一类重要的免疫抑制分子，其作为“关闭的开关”发挥功能，抑制T细胞攻击体内的其它细胞。当T细胞表面的PD-1与体内正常细胞上表达的PD-1配体PD-L1(programmeddeathligand-1,程序性死亡配体1)时，T细胞的细胞杀伤效果受到抑制。肿瘤细胞利用这一机制逃避T细胞的免疫攻击，其表达大量PD-L1，以与T细胞表面的PD-1联合，抑制其细胞杀伤效果。针对PD-1或PD-L1免疫检查点的抑制剂，例如单克隆抗体药物能够阻断PD-1与PD-L1联合，抑制其下游信号传导，从而增强T细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用。根据目前的临床研究和临床前研究，PD-1抗体药物在多种癌症的治疗中表现出显著的效果，包括多种消化道癌症、黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等。然而，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫信号通路调节剂在癌症治疗方面也存在诸多问题，其中以响应率低最为突出。研究表明，靶向PD-1/PD-L1的药物治疗的患者响应率通常不超过40％，而采用CTLA-4单抗药物-ipilimumab治疗的患者其响应率仅约为15％，并且其中一部分患者仅为局部应答。此外，此类治疗还存在以下问题：起效慢，其中位起效时间为12周，可能会耽误患者的救治时间；部分患者治疗效果较差；在患者体内引起副作用，诸如结肠炎、腹泻、皮炎、肝炎、内分泌疾病等免疫相关不良反应(immune-relatedadverseevents,irAEs)，可能导致治疗提前终止；以及价格昂贵，令普通患者难以承担。
技术实现思路
本公开的目的在于提供一种健康人肠道菌群的菌液，及其与免疫信号通路调节剂联合，用于治疗肿瘤患者，以提高肿瘤对免疫治疗的应答。具体来讲，本公开提供了一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；对样本进行均质化；对均质化的液体进行逐级过滤；将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；所述方法在厌氧条件下进行。优选地，上述制备方法，其中，所述第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。优选地，上述制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：使用无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换，盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部；按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；对样本粪便进行均质化；对进行均质化的液体进行逐级过滤，优选地，所述逐级过滤为1mm-2mm、400-600μm、20-80μm；将滤液转移至离心管内，离心2次，第一次离心条件为，50g-200g，离心5-7分钟，第二次离心条件为，4000g-5500g，离心5-7分钟，收集菌体沉淀。用50mL无菌去氧生理盐水重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物。优选地，上述制备方法，所述第一次、第二次离心温度优选为0-25℃，或0-15℃，或1-10℃，或2-8℃，最优选为4℃优选地，上述制备方法，其中，所述方法还包括以下步骤：粪便来源的质量控制步骤；和/或，人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤。更优选地，所述粪便来源的质量控制步骤包括选择18-40岁健康人，通过健康筛查和临床检查，所述健康筛查和临床检查包括：血液检查无HIV、乙肝病毒、EB病毒等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒，诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属、耐碳青霉烯类抗生素肠杆科细菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、产超广谱beta-内酰胺酶肠杆科细菌、白色念珠菌、隐孢子虫及环孢子虫感染；三餐规律，作息规律；所述人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤包括：无菌去氧生理盐水重悬所得菌液中，计数活菌率>5x1010个/ml视为合格。本公开还提供上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物。本公开还提供包含上述任一种制备方法制得的人肠道菌群全菌组合物，以及药学上可接受的载体的药物组合物。特别地，本公开提供一种治疗癌症的试剂盒，其包上述的人肠道菌群全菌组合物或药物组合物，以及PD-1抗体。本公开还提供上述的人肠道菌群全菌组合物在制备用于治疗癌症的药物或试剂盒中的用途；优选地，所述癌症为消化道肿瘤；更优选地，所述癌症为结直肠癌。优选地，上述用途，其特征在于所述药物或试剂盒中还包括一种或多种免疫信号通路调节剂；优选地，所述免疫信号通路调节剂包括抑制PD1/PDL1、PD1/PDL2、CD28/B7-1(CD80)、CD28/B7-2(CD86)、CTLA4/B7-1(CD80)、CILA4/B7-2(CD86)、4-1BB(CD137)/4-1BBL(CD137L)、ICOS/B7RP1、CD40/CD40L、疱疹病毒进入调控因子(Herpesvirusentrymediator，HVEM)/B-及T-淋巴细胞衰减因子(B-andT-lymphocyteattenuator,BTLA)、OX40/OX40L、CD27/CD70、GITR/GITRL、KIR/MHC、淋巴细胞活化基因3(LA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：/n将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；/n对样本进行均质化；/n对均质化的液体进行逐级过滤；/n将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；/n所述方法在厌氧条件下进行。/n

【技术特征摘要】
1.一种健康人肠道菌群全菌组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
将健康人粪便按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌；
对样本进行均质化；
对均质化的液体进行逐级过滤；
将滤液离心后重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物；
所述方法在厌氧条件下进行。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，离心2次，第一次离心条件为50g-200g，离心1-15分钟；第二次离心条件为4000g-5500g，离心1-15分钟。


3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述方法包括以下步骤：
使用无菌粪便采集盒收集新鲜粪便样本，取样后盖上盖子，送至实验室进行称量，并记录质量；
将采样盒放入在厌氧操作台的传递窗内，打开盒盖确保气体交换，盖上传递窗盖，启动去氧程序；5分钟后，将采样盒转移至操作台内部；
按照1:3-5的质量体积比加入的无菌去氧生理盐水，对样本进行搅拌，确保粪便不过分粘在采样盒上；
对样本粪便进行均质化；
对进行均质化的液体进行逐级过滤，优选地，所述逐级过滤为1mm-2mm、400-600μm、20-80μm；
将滤液转移至离心管内，离心2次，第一次离心条件为50g-200g，离心5-7分钟，第二次离心条件为4000g-5500g，离心5-7分钟，收集菌体沉淀；
用50mL无菌去氧生理盐水重悬，所得悬液即人肠道菌群全菌组合物。


4.根据前述任一项权利要求所述的制备方法，其中，所述方法还包括以下步骤：
粪便来源的质量控制步骤；和/或，
人肠道菌群全菌组合物的质量控制步骤。


5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述粪便来源的质量控制步骤包括选择18-40岁健康人，通过健康筛查和临床检查，所述健康筛查和临床检查包括：血液检查无HIV(humanimunodeficiencyvirus、乙肝病毒、EB病毒(epstein-barrvirus,EBV)等感染；身体无消化道疾病及其他会影响肠道菌群的疾病如代谢综合征等；粪便检查无轮状病毒、诺如病毒、沙门氏菌、志贺菌属...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹意铭，谭验，刘玎，张聪，高婷，
申请(专利权)人：深圳未知君生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44