咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。本发明专利技术说明了咯利普兰可显著降低脂多糖诱导的心肌成纤维细胞炎症因子的转录和分泌，上调双特异性磷酸酶转录和表达；咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症反应的调控作用依赖于双特异性磷酸酶；利普兰可显著降低内毒素血症心脏组织中炎症因子转录水平和蛋白浓度、上调双特异性磷酸酶转录和表达；咯利普兰可显著改善内毒素血症小鼠心脏组织炎性细胞浸润程度；咯利普兰可显著改善内毒素血症小鼠心脏收缩功能，本技术方案以心肌成纤维细胞为干预靶点，证实咯利普兰可通过上调双特异性磷酸酶抑制心肌成纤维细胞炎症反应，显著改善脓毒症心功能。

Application of rolipram in the preparation of drugs for the treatment of sepsis and cardiac dysfunction

【技术实现步骤摘要】
咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用
本专利技术涉及咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。
技术介绍
脓毒症是由于感染导致机体免疫失衡而导致的脏器功能障碍，是重症患者的主要死亡原因之一。其中，约有40％-50％脓毒症患者并发心功能障碍，并发心功能障碍的患者死亡风险明显增加，而目前对于脓毒症心功能障碍尚缺乏公认有效治疗方案。心肌成纤维细胞是心脏组织中重要的支持细胞，同时发挥重要免疫监视作用，在感染、损伤等情况下，可显著活化，释放炎症因子等，放大炎症反应。近年来的研究发现，炎症因子可能作为一种心肌抑制分子，导致心功能障碍。因此，本技术以心肌成纤维细胞为干预靶点以提供脓毒症心功能障碍的治疗措施。咯利普兰是一种磷酸二酯酶抑制剂，可降低细胞内环磷酸腺苷水平而发挥抗炎作用，已被美国食品及药物管理局批准应用于慢性阻塞性肺疾病。而咯利普兰在脓毒症心功能障碍中的应用目前尚无报道。
技术实现思路
基于以往研究报道，为了克服以上缺陷，本专利技术提出了咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。本专利技术通过咯利普兰在脓毒症心功能治疗中的实验依据及动物水平的验证，为治疗应用提供了基础。本专利技术以心肌成纤维细胞为干预靶点，证实咯利普兰可通过上调双特异性磷酸酶抑制心肌成纤维细胞炎症反应，显著改善脓毒症心功能。附图说明图1为LPS刺激后心肌成纤维细胞炎症反应及DUSP1表达变化图；图2为咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症反应的作用示意图；图3为敲低DUSP1后咯利普兰对心肌成纤维细胞炎症因子分泌的影响图；图4为咯利普兰对内毒素血症小鼠心肌组织中炎症水平及DUSP1表达的影响图；图5为咯利普兰对内毒素血症小鼠心肌组织中炎性细胞浸润情况影响图；图6为咯利普兰处理对内毒素血症小鼠心功能影响图。具体实施方式咯利普兰在脓毒症心功能治疗中的实验依据及动物水平的验证，本方案同时在体外培养的心肌成纤维细胞和内毒素血症模型上为咯利普兰的效应提供了实验基础。动物和试剂：C57BL/6小鼠购自南方医科大学。所有动物处理程序已获南方医科大学(许可证编号2017J019)动物护理及使用委员会批准，所有动物实验按照南方医学部动物护理指南进行大学。LPS-脂多糖(L2630)和rolipram-咯利普兰(R6520)是从Sigma-Aldrich购买的。用于消化心脏组织的酶LiberaseTH纯化研究级(054011501)从罗氏(德国曼海姆)购买。RNA提取试剂TRIzol是从LifeTechnologies(中国上海)购买的。反转录试剂盒(FSQ-101)和Real-timePCRMasterMix(QPK-201)试剂盒是从丰田(日本大阪)购买。酶联免疫吸附试验(ELISA)TNF-α(88-7324-22)、IL-6(88-7064-86)和IL-1β(88-7013-86)试剂盒购自ThermoFisher科技公司(加州圣地亚哥，美国)。DUSP1抗体(sc-373841)是从SantaCruz(美国德克萨斯州达拉斯)购买的，并且GAPDH(#2118)购自CellSignalingTechnology(马萨诸塞州丹佛市，美国)。二级抗体辣根过氧化物酶(HRP)结合羊抗兔IgG(abs20040)和山羊抗鼠IgG(abs20039)均购自Absin(中国上海)。Fluorochrome7-AAD(00-6993-50)购自ThermoFisher(美国)和特异性抗体142Cd45-FITC(553080)和Ly6g-APC-Cy7(560600)购自BDBiosciences(加利福尼亚州圣何塞，美国)。新生小鼠心脏成纤维细胞的分离与治疗从新生C57BL/6小鼠心脏中分离出新生鼠心肌成纤维细胞，麻醉后将新生鼠心脏分离并切成碎片。然后，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗心脏组织，并在37℃下用酶(LiberaseTHResearchGrade)消化15分钟。将含有细胞的上清液转移至完全培养基(含有10％胎牛血清的DMEM)以终止消化。剩余组织在37℃酶解15min后进一步消化。消化重复3-4次，从心脏组织中分离出所有细胞。收集所有细胞悬液，250×g离心5min，丢弃上清液，在完全培养基中再悬浮。细胞悬液被转移到培养皿，在37℃和5％二氧化碳的培养箱中培养60分钟。丢弃未附着的细胞后，剩余的附着细胞为心脏成纤维细胞，细胞培养24小时后，根据先前的研究，分别用1μg/mlLPS处理6小时或10μmol/Lrolipram处理1小时，然后单独或联合LPS刺激。由于LPS溶于生理盐水(NS)，rolipram溶于二甲基亚砜(DMSO)，NS和DMSO作为溶剂对照。内毒素血症小鼠模型的制备及治疗20只C57BL/6小鼠，雄性，8～10周龄，随机分为4组(n＝5)。根据我们先前的研究，用15mg/kg的LPS腹腔注射6h建立内毒素血症小鼠模型，LPS注射前1h腹腔注射10mg/kg的咯利普兰(rolipram)，以NS和DMSO为溶剂对照组。RNA提取和定量RT-PCR(qRT-PCR)用TRIzol试剂从心肌成纤维细胞或心肌组织中提取总RNA。RNA提取和qRT-PCR均按上述方法进行，TNF-α、IL-6、IL-1β、DUSP1和GAPDH的引物序列见下表1。表达结果用Livak和Schmittgen报道的2-ΔΔCq法计算。表1TNF-α、IL-6、IL-1β、DUSP1和GAPDH的rt-PCR引物序列蛋白质提取从培养的心肌成纤维细胞或心肌中提取蛋白质组织溶解缓冲液(P0013B，Beyotime)。对培养的心肌成纤维细胞，去除培养基，用冷PBS洗涤3次。然后，用裂解缓冲液在冰上裂解细胞20分钟。然后，收集裂解细胞并在12000×g下离心15分钟以获得颗粒碎片，然后使用上清液进行后续测量。心脏组织蛋白的采集采用超声裂解法。超声探头频率为20khz。将组织放入带300μl裂解缓冲液的1.5ml微离心管中，在sonnicator探针尖下轻轻移动10秒振动。然后，在冰上孵育15分钟超声波。然后在12000×g离心20分钟，收集上清液进行蛋白质分析。采用BCA蛋白测定法(ThermoFisher，USA)测定蛋白浓度，酶免疫法和westernblot法检测总蛋白。酶免疫分析(ELISA法)细胞上清液中肿瘤坏死因子α、白细胞介素-6和白细胞介素-1β的酶免疫测定并根据制造商的指南进行心脏组织检查。在96孔板上分别涂上TNF-α(1:250稀释)、IL-6(1:250稀释)和IL-1β(1:250稀释)的捕获抗体，在4℃孵育过夜，用稀释缓冲液封闭1h，然后加入标准样品和实验样品，在室温下孵育2h。加入相应的检测抗体TNF-α(1:250稀释)、IL-6(1:250稀释)和IL-1β(1:250稀释)、亲和素辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)溶液，用1mol/LH3PO4终止本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.咯利普兰在制备治疗脓毒症心功能障碍的药物中的应用。


2.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志锋，吉晶晶，苏磊，
申请(专利权)人：中国人民解放军南部战区总医院，
类型：发明
国别省市：广东;44