基于CeVO制造技术

本发明专利技术属于分析化学技术领域，涉及一种基于CeVO

Based on cevo

【技术实现步骤摘要】
基于CeVO4的碱性磷酸酶活度比色检测法
本专利技术属于分析化学
，涉及碱性磷酸酶的检测，尤其涉及一种基于CeVO4的碱性磷酸酶活度比色检测法。
技术介绍
碱性磷酸酶(ALP)是一种生物酶，广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘中，这种酶能催化多磷酸化物质(例如核酸，蛋白质和小分子)脱去一分子的磷酸基团。ALP的活性范围为40～190U/L。大量研究表明，ALP活性异常与多种疾病密切相关，包括骨损伤、肝功能障碍和前列腺癌。例如，ALP是早期成骨细胞分化过程中成骨细胞活性的重要指标，其活性通常随骨活性的增加而增加。当其活性超过上限时，表示在此过程中可能发生活性骨沉积。另外，其他骨病，例如软骨病、狼疮炎和骨癌，也会导致ALP活性增加。此外，肝胆疾病患者经常发现ALP指标偏高，而严重的慢性肾炎、甲状腺功能低下和贫血会导致ALP活性偏低。因此，它被普遍用作诊断和治疗这些疾病的临床生物标志物。此外，ALP经常用于各种酶联免疫吸附测定(ELISA)中。基于这些广泛需求，开发有效、低成本且易于使用的ALP活性分析方法具有重要意义。目前碱性磷酸酶的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法等。例如：中国专利CN110501317A，公开了一种检测碱性磷酸酶的荧光检测方法，将4-羟基苯基磷酸钠(4-HPP)作为底物,在水溶液中,该底物分子经碱性磷酸酶的催化水解生成1,4-苯二酚(HQ),1,4-苯二酚可以与后续加入的3-(2-氨基乙基氨基)丙基三甲氧基硅烷(DAMO)发生反应,生成绿色荧光发射的硅纳米粒子(SiNPs)。体系中的碱性磷酸酶活性越高,生成的荧光硅纳米粒子就越多,荧光强度就越大,根据检测溶液的荧光强度变化,进行碱性磷酸酶活性的定量分析检测。中国专利CN108084995B，公开了一种利用CuInS/ZnS量子点及利用该量子点检测碱性磷酸酶的方法。以CuInS/ZnS量子点做为碱性磷酸酶水解4-硝基苯磷酸二钠体系中的探针,通过荧光强度的变化以及碱性磷酸酶与荧光强度的线性关系,得到碱性磷酸酶的含量。该专利技术制备的CuInS/ZnS量子点最佳激发波长为405nm,与PNP的最大底物吸收峰重叠,能够产生内滤效应,从而达到检测ALP的目的。中国专利CN107422014A，公开了一种定量检测碱性磷酸酶的方法,通过制备修饰电极,然后利用碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯脱去磷酸根生成具有强还原性的抗坏血酸,而抗坏血酸将反应液中的银离子还原为银单质并沉积电极表面上,最后利用修饰电极表面所沉积银的溶出伏安信号来实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。中国专利CN107422014B，公开了一种用于检测碱性磷酸酶的修饰电极及制备方法与检测方法。该专利技术首先制备修饰电极,然后利用碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸2-磷酸酯脱去磷酸根生成具有强还原性的抗坏血酸,而抗坏血酸可以迅速将反应液中的银离子还原为银单质,并沉积电极表面上,最后利用修饰电极表面所沉积银的溶出伏安信号来实现对碱性磷酸酶的高灵敏检测。检测完成以后还可以通过简单的方法使修饰电极得到再生,以便能够重复利用。上述已公开的碱性磷酸酶检测方法虽然具有一定的检测效率，但仍有以下缺点和不足：1)检测方法操作相对复杂；2)有些检测方法对环境要求苛刻，成本相对较高，试剂保存条件要求高。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种基于CeVO4的碱性磷酸酶活度比色检测法。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种基于CeVO4的碱性磷酸酶活度比色检测法，包括如下步骤：1)分别于5mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.05mL1mM六偏磷酸钠(NaPO3)6，反应30～60min，优选50min；所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为1U/L、15U/L、30U/L、50U/L、70U/L、90U/L、130U/L、170U/L、210U/L；2)再向混合液中依次加入0.1mL1mg/mL的CeVO4悬浮液、0.1mL5mM的TMB、醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min，优选5min；3)将上述混合溶液过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度；4)将上述TMBox的吸光度测量值与对应的ALP活度绘制校准后的ALP活度-吸光度标准工作曲线；5)待测ALP样品重复步骤1)～4)，用紫外-可见吸收分光光度计分别测定以TMB为底物波长为652nm处时的吸光度，通过计算，经与标准工作曲线比对，即可获得ALP活度。本专利技术较优公开例中，步骤2)中所述醋酸盐缓冲液pH为4，浓度0.2M。本专利技术较优公开例中，步骤5)中所述待测ALP样品的可检测活度范围为1～210U/L，检测限低至0.68U/L。本专利技术以CeVO4为类氧化酶模拟物，在酸性条件下，催化氧气产生的超氧阴离子与显色剂(TMB)之间的反应，产生显色产物(TMBox)，使整个体系变蓝。由于六偏磷酸钠[(NaPO3)6]带较强的负电性，向上述体系中加入六偏磷酸钠后，带正电的TMBox会和六偏磷酸钠产生团聚，可以影响体系的颜色。碱性磷酸酶(ALP)可以水解六偏磷酸钠产生磷酸根，磷酸根对上述体系几乎无影响。因此本专利技术可以通过一定时间内不同活度的碱性磷酸酶水解体系中的六偏磷酸钠引起体系颜色的变化实现对碱性磷酸酶活度的检测。本专利技术中，ALP可以促进TMB的显色，利用TMBox的吸光度与ALP活度的线性关系进行运算处理，从而得到更稳定可靠的检测数据，据此可测定人体血清中ALP的活度。在本说明书中，术语“类氧化酶”是指具有氧化酶催化活性的材料。具体地，本专利技术的类氧化酶以氧气作为电子受体，通过催化氧化相应底物生成有色物质，用于比色检测。在本说明书中，术语“(NaPO3)6”是化合物六偏磷酸钠的化学式，二者可互换使用。在本说明书中，术语“TMB”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”的缩写名称，二者可互换使用。在本说明书中，术语“TMBox”是化合物“3,3’,5,5’-四甲基联苯胺”氧化产物的缩写名称，二者可互换使用。在本说明书中，术语“ALP”是指碱性磷酸酶，二者可互换使用。在本说明书中，术语“CeVO4”是指钒酸铈的化学式，二者可互换使用。本专利技术所述钒酸铈(CeVO4)，依据现有技术制备而成，在此公开一种制备方法，包括如下步骤：1.将质量比为1:3～5的偏钒酸铵(NH4VO3)与六水合硝酸铈[Ce(NO3)3·6H20]溶于超纯水中，超声搅拌0.5～1h，形成黄色的均匀溶液，其中偏钒酸铵、六水合硝酸铈与超纯水的固液比为1：3～5：30。2.将溶液移入反应釜，160～200℃水热反应10～12h；3.自然冷却后，以9000～11000r/min的转速离心5～6min分离，用乙醇洗涤干净，35～45℃真空干燥12h，即得。进一步的，步骤1所述偏钒酸铵、六水合硝酸铈与超纯水的固本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CeVO

【技术特征摘要】
1.一种基于CeVO4的碱性磷酸酶活度比色检测法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别于5mL离心管中加入不同活度的碱性磷酸酶和0.05mL1mM六偏磷酸钠(NaPO3)6，反应30～60min，所述碱性磷酸酶在体系内的最终活度为1U/L、15U/L、30U/L、50U/L、70U/L、90U/L、130U/L、170U/L、210U/L；
2）向混合液中依次加入0.1mL1mg/mL的CeVO4悬浮液、0.1mL5mM的TMB、醋酸盐缓冲液，确定溶液最终总体积为3mL，混匀体系后反应1～30min；
3）将上述混合溶液过膜后用紫外-可见吸收分光光度计测定混合溶液紫外吸收光谱，记录波长为652nm处的吸光度并绘制以TMB为显色剂的碱性磷酸酶活度-吸光度标准工作曲线；
4）将上述TMBox的吸光度测量值与对应的碱性磷酸酶活度绘制校准后的碱性磷酸酶活度-吸光度标准工作曲线；
5）待测碱性磷酸酶样品重复步骤1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶堃，牛湘衡，李欣，王林杰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32