用于筛选剪接变异体或事件的方法技术

本发明专利技术涉及一种筛选靶基因的剪接变异体作为药物靶标或用于表征其生物学功能的高通量方法。本公开提供了一种用于筛选剪接变异体的方法，包括：(a)提供能够在靶基因上诱导第一剪接事件以表达第一剪接变异体的第一反义寡核苷酸以及能够在靶基因上诱导第二剪接事件以表达第二剪接变异体的第二反义寡核苷酸；(b)使第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA杂交；以及(c)表征剪接事件的效应。在一个实施例中，第一反义寡核苷酸将表达第二剪接变异体的剪接事件转换为表达第一剪接变异体的剪接事件，而第二反义寡核苷酸将表达第一剪接变异体的剪接事件转换为表达第二剪接变异体的剪接事件。

Method used to filter splice variants or events

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于筛选剪接变异体或事件的方法
本专利技术涉及一种筛选至少一个靶基因的剪接变异体或事件的方法。具体地，该方法涉及高通量筛选靶基因的剪接变异体或亚型作为药物靶标或用于表征其在全转录组范围内的生物学功能。在各种实施例中，该方法采用使用剪接转换空间位阻反义寡核苷酸来筛选和鉴定由选择性剪接或异常剪接产生的亚型作为药物靶标。本方法使用这种剪接转换空间位阻反义寡核苷酸来表征由选择性剪接或异常剪接产生的亚型的生物学功能。
技术介绍
下一代测序(NGS)的成本降低迅速发现了全转录组范围的不同的选择性剪接(AS)和环状剪接(CS)事件，该全转录组范围以特定肿瘤(比如)与其对应正常细胞(参见图1a)之间数百至数千个亚型变异体和剪接事件计数。在前者中，癌症相关亚型所翻译的蛋白质具有与从其正常对应物中表达的亚型翻译的蛋白质相反的生物学功能。比如，缺乏外显子16的从癌细胞中表达的亚型翻译的短型IG20/MADD蛋白质抑制了细胞死亡，而在正常细胞中表达的保留外显子16的长型亚型翻译促进细胞死亡的蛋白质。在另一示例中，具有外显子12A包含的BIN1的长亚型在黑色素瘤中表达，而短亚型(没有外显子12A)在黑素细胞中表达(一些示例，参见图2)。对于后者，已经观察到健康细胞和患病细胞之间以及处于各种生理状态的细胞之间circRNA的差异表达。重要的是，特定circRNA的表达或缺乏与包括动脉粥样硬化、癌症和帕金森氏病在内的疾病相关。尽管研究已经表明选择性剪接在生成蛋白质多样性中发挥主要作用，并且其失调与人类疾病有关，但是标准分析不可能实现全面审视选择性剪接和异常剪接如何调节基因功能。后基因组学时代的巨大挑战在于缺乏用于高通量功能基因组学研究的经验证的平台技术，该技术可以与大量数据生成保持同步。在这种背景下，非常需要用于对数千种选择性剪接亚型、剪接事件和/或环状剪接circRNA中的每个进行功能研究以鉴定作为用于进行治疗靶向的疾病驱动机制的平台技术。在本说明书中列举或讨论显然是现有出版的文档不一定应当看作是承认该文档是现有技术的一部分或是公知常识。本文中所引用的任何文档的全部内容均通过引用并入。
技术实现思路
在本专利技术的一方面中，提供了一种用于筛选靶基因的剪接变异体或事件的方法，该方法包括：(a)提供能够在靶基因上诱导第一剪接事件以表达第一剪接变异体的第一反义寡核苷酸以及能够在靶基因上诱导第二剪接事件以表达第二剪接变异体的第二反义寡核苷酸；(b)使第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA杂交；以及(c)表征剪接事件的效应。具体地，本专利技术的方法包括：鉴定细胞组之间亚型的差异表达或鉴定在细胞组中相似表达的亚型的表达。可以包括用药物和/或生物试剂或过程处理之前或之后的细胞之间或在经受生物学过程(诸如发育或分化)之前和之后的无病细胞和有病细胞之间的差异表达。在各种实施例中，本专利技术提出了一种单向剪接转换筛选方法，其中，单个AON诱导或引起剪接事件发生，并且所述方法包括以下步骤：通过查看细胞的表型来表征该事件，该表型表达该亚型；并且确定剪接事件对细胞具有什么影响，即，剪接事件如何并且以何种状态改变细胞的表型。例如，AON可以引起剪接事件，该剪接事件导致靶基因的亚型的表达，该亚型导致原本健康的细胞患病或不健康。在下文进行详细描述的其他实施例中，公开了一种双向剪接转换筛选，其中，本专利技术的AON用于表征来回转换两个亚型的表达的剪接事件。“剪接变异体”意指包括源自单个靶基因或基因家族的任何蛋白质亚型。这些蛋白质亚型可以由任何这种“剪接事件”或机制(诸如选择性剪接或其他转录后修饰)来形成或产生。该术语还包括在结构和组成上都可以不同的任何多种蛋白质亚型。通过这种剪接事件，细胞机制能够从基因中选择不同蛋白质编码片段(外显子)，甚至从RNA中选择外显子的不同部分以形成不同的mRNA序列。为了适当表达绝大多数蛋白质编码基因，需要剪接前体mRNA，因此，靶向该过程提供了一种操纵由基因产生蛋白质的手段。在本文中，术语“剪接变异体”和“亚型”可以互换使用。本文在下文描述了可能的剪接事件的完整列表。剪接过程实际上是由剪接因子介导的一系列反应，该反应在转录之后但在翻译之前对新生RNA进行。因此，“前体mRNA”是既包含外显子又包含一个或多个内含子的RNA，而“mRNA”是一个或多个内含子已经移除并且外显子依次接合在一起使得核糖体可以从中翻译出蛋白质的RNA(成熟mRNA)。由多个同时剪接事件中的一个剪接事件产生的靶基因的剪接变异体或选择性剪接变异体包括已知转录物和带注释的转录物以及新颖转录物和/或无带注释的转录物。“寡核苷酸”是指任何多核苷酸。“多核苷酸”是由核苷酸组成的寡聚物。多核苷酸可以由DNA、其RNA修饰形式、或其组合组成。本文中所使用的术语“核苷酸”或其复数可与本文中所讨论的或本领域已知的修饰形式互换。在某些实例中，本领域使用术语“核碱基”，其涵盖天然存在的核苷酸以及可以聚合的核苷酸的修饰。因此，核苷酸或核碱基意指天然存在的核碱基：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)；以及非天然存在的核碱基，诸如黄嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脱氮黄嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N4,N4-乙醇胞嘧啶(ethanocytosin)、N’,N’-乙醇-2,6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶(mC)、5-(C[3]-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基-5-甲基-4-三唑并吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷、以及在Bermer等人的美国专利第5,432,272号以及SusanM.Freier和Karl-HeinzAltmann于1997年《核酸研究(NucleicAcidsResearch)》第25卷第4429至4443页中描述的“非天然存在的”核碱基。此外，术语“核碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括其杂环类似物和互变异构体。其他天然存在的核碱基和非天然存在的核碱基包括在美国专利第3,687,808号(Merigan等人)公开的核碱基；Sanghvi在《反义研究与应用(AntisenseResearchandApplication)》的第15章公开的核碱基；Ed.S.T.Crooke和B.Lebleu，CRC出版社，1993中公开的核碱基；Englisch等人，1991，AngewandteChemie，国际版，30：613-722(尤其参见第622和623页，以及《高分子科学和工程学简明百科全书(ConciseEncyclopediaofPolymerScienceandEngineering)》，J.I.KroschwitzEd.，JohnWiley&Sons，1990，第858至859页，Cook，抗癌药物设计(Anti-CancerDrugDesign)1991，6，第585至607页中公开的核碱基，其中每篇通过引用整体并入本文。在各个方面中，多核苷酸还包括一个或多个“核苷碱基”或“碱基单元”，其包括可以用作核碱基的诸如杂环化合物之类的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于筛选靶基因的剪接变异体或事件的方法，该方法包括：/n(a)提供能够在靶基因上诱导第一剪接事件以表达第一剪接变异体的第一反义寡核苷酸以及能够在靶基因上诱导第二剪接事件以表达第二剪接变异体的第二反义寡核苷酸；/n(b)使第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA杂交；以及/n(c)表征剪接事件的效应。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170811 SG 10201706585X1.一种用于筛选靶基因的剪接变异体或事件的方法，该方法包括：
(a)提供能够在靶基因上诱导第一剪接事件以表达第一剪接变异体的第一反义寡核苷酸以及能够在靶基因上诱导第二剪接事件以表达第二剪接变异体的第二反义寡核苷酸；
(b)使第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA杂交；以及
(c)表征剪接事件的效应。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA的杂交在板模板中的单独孔中进行。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，第一剪接事件和第二剪接事件是相反事件，第一反义寡核苷酸诱导剪接事件，而第二反义寡核苷酸逆转剪接事件。


4.根据权利要求1所述的方法，还包括：
(a)提供细胞组，该细胞组具有靶基因的两个或更多个剪接变异体或事件；以及
(b)使第一反义寡核苷酸与所表达的靶基因的前体mRNA杂交，并且使第二反义寡核苷酸与所表达的靶基因的前体mRNA杂交。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，第一反义寡核苷酸将表达第一剪接变异体的靶基因的剪接事件转换为表达第二剪接变异体的剪接事件，并且第二反义寡核苷酸将表达第二剪接变异体的靶基因的剪接事件转换为表达第一剪接变异体的剪接事件，第一反义寡核苷酸和第二反义寡核苷酸与靶基因的前体mRNA的杂交在板模板的单独孔中进行。


6.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括：
(a)提供第一细胞组和第二细胞组，每个细胞组具有靶基因的不同剪接变异体或事件；以及
(b)将第一反义寡核苷酸与在第一细胞组中表达的靶基因的前体mRNA杂交，并且将第二反义寡核苷酸与在第一细胞组中表达的靶基因的前体mRNA杂交。


7.根据权利要求6所述的方法，其中，第一反义寡核苷酸将在第一细胞组中表达的靶基因的剪接事件转换为第二细胞组的剪接事件，并且第二反义寡核苷酸将在第二细胞组中表达的靶基因的剪接事件转换为第一细胞组的剪接事件。


8.根据权利要求7所述的方法，其中，确定剪接变异体的效应的步骤包括：鉴定由靶基因表达的剪接变异体。


9.根据权利要求8所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏建汶，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG