具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法技术

本发明专利技术提供一种具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法等。具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法包括：将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度；在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液；以及在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。

Preparation method of cell extract components or compositions with cell killing activity

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分或组合物的制备方法
本专利技术涉及一种具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，以及具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的制备方法等。
技术介绍
在培养细胞的情况下，对于许多确立的细胞株，如果在细胞增殖而覆盖培养容器表面的时期时用胰蛋白酶等分散、将细胞在新鲜的培养基中稀释、向其他培养容器转移并进行培养，则它们能够进行无限增殖。此过程称为传代，但如果不进行传代而直接继续培养，则细胞会死亡。在专利文献1中，公开了从培养恶性肿瘤细胞后的培养基中去除肿瘤细胞而获得恶性肿瘤细胞增殖抑制剂。然而，从培养基中去除恶性肿瘤细胞而获得的剩余物是含有极为复杂的物质的组合物，认为从这样的组合物分离具有抗肿瘤活性的物质会非常困难，并且事实上是不可能的。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开昭59-33223号公报
技术实现思路
迄今为止以癌症治疗为目的而进行了各种治疗剂的研究与开发，但以往的抗癌剂副作用大，往往不能获得足够的效果，因此仍需寻求进一步的药剂开发。根据本专利技术的一个方面，可以提供一种用于从培养的细胞制造能够用作新型抗癌剂的组合物，或者可用于获得作为新型抗癌剂而有用的物质的组合物的方法。另外，根据本专利技术的一个方面，可以提供一种能够获得具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分的方法。本专利技术人等进行了深入研究，结果新发现：在细胞覆盖培养容器表面并进一步增殖为过密度(overpopulation)而出现增殖受到抑制的时期，即使更换培养基来补充充分的营养源和能源也会出现在不进行传代而继续培养细胞的情况下的细胞死亡的现象。另外，本专利技术人等新发现：即使将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度并且然后将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液(不含营养源和/或能源)的情况下，所述细胞也产生了导致自身最终死亡的物质。这个发现表明，细胞仅以在细胞内存在的物质为材料产生具有细胞杀伤活性的物质，导致自身最终死亡。这样的发现迄今为止未在任何报告中有所提示，并且能够利用生理缓冲盐溶液获得从恶性肿瘤来源的细胞提取的具有细胞杀伤活性的成分，是完全出乎意料的。本专利技术的一种实施方案涉及以下内容：〔1〕具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，以及在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。〔2〕根据上述〔1〕所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖。〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液选自由汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液和磷酸盐缓冲生理盐水组成的组。〔4〕根据上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的制造方法，还包括：获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，以及将所述干燥物溶解在介质中，从得到的溶液中去除盐类、核酸和蛋白质。〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的制造方法，其中，所述具有细胞杀伤活性的组合物包含来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。〔6〕细胞提取物成分的制备方法，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分具有细胞杀伤活性，该方法包括：将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液，获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，使用含有碳原子数为1～3的醇的溶剂提取所述干燥物，对得到的溶液进行干燥，将所述溶液的干燥物溶解于水中，向得到的水溶液中添加非极性有机溶剂以形成水层和有机层，并提取所述水层，以及通过色谱从所述水层分离来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。〔7〕根据上述〔6〕所述的制备方法，其中，所述色谱包括凝胶过滤色谱和/或阳离子交换色谱。〔8〕根据上述〔1〕～〔7〕中任一项所述的制造方法或制备方法，其中，所述恶性肿瘤来源的细胞是未进行基因操作且在不加入除培养液以外的生理活性物质的情况下培养的细胞。〔9〕具有细胞杀伤活性的组合物，其是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。〔10〕细胞提取物成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。〔11〕用于癌症治疗的药物组合物，其含有具有细胞杀伤活性的组合物，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。〔12〕用于癌症治疗的药物组合物，其含有细胞提取物成分作为有效成分，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。〔13〕具有细胞杀伤活性的组合物在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述具有细胞杀伤活性的组合物是通过上述〔1〕～〔5〕和〔8〕中任一项所述的制造方法获得的。〔14〕细胞提取物成分在用于制造治疗癌症用的药物中的用途，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分是通过上述〔6〕或〔7〕所述的制备方法获得的。根据本专利技术的一个方面，能够廉价、简便和/或在短时间内制造能够用作新型抗癌剂的组合物或可用于获得作为新型抗癌剂而有用的物质的组合物。根据本专利技术的一个方面，能够廉价、简便和/或在短时间内获得具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分。具有细胞杀伤活性的细胞提取物成分对各种的癌症均有效。附图说明图1是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用含血清培养基(含10％FBS的Eagle'sMEM)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。图2是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用无血清培养基(Eagle'sMEM)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。图3是示出HRC23的细胞生存率的平均值与标准偏差的半对数图，所述细胞生存率是使用生理缓冲盐溶液(不含葡萄糖的汉克氏平衡盐溶液：HBSS-)在由HRC23制作的测试样品的连续稀释系列中通过MTT分析测定的。横轴以常用对数标度表示测试样品的浓度(原液mL/mL)。图4是利用凝胶过滤色谱的色谱图。在A～H的8个组分中，检测到细胞杀伤活性的A组分用斜线示出(105分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：/n将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，/n在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，以及/n在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171005 JP 2017-1949881.具有细胞杀伤活性的组合物的制造方法，包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，以及
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液。


2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液不含有葡萄糖。


3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述生理缓冲盐溶液选自由汉克氏平衡盐溶液、厄尔氏平衡盐溶液和磷酸盐缓冲生理盐水组成的组。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，还包括：
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，以及
将所述干燥物溶解在介质中，从得到的溶液中去除盐类、核酸和蛋白质。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，所述具有细胞杀伤活性的组合物包含来自所述恶性肿瘤来源的细胞的细胞提取物成分。


6.细胞提取物成分的制备方法，所述细胞提取物成分来自恶性肿瘤来源的细胞，其中，所述细胞提取物成分具有细胞杀伤活性，该方法包括：
将恶性肿瘤来源的细胞在培养基中培养至细胞的密度至少达到不会妨碍传代的密度，
在所述培养后，将所述培养基更换为生理缓冲盐溶液，
在所述生理缓冲盐溶液中，在从所述恶性肿瘤来源的细胞的形态学上观察到细胞死亡的时期之后，回收所述生理缓冲盐溶液，
获得含有所述回收的生理缓冲盐溶液中分子量为1kDa以下的组分的干燥物，
使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：田岛知行，近藤良房，
申请(专利权)人：医疗法人社团市川诊所，
类型：发明
国别省市：日本;JP