体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用技术

本发明专利技术提供了体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用。在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：S01、构建第一重组质粒，第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将第一重组质粒载体进行过表达，得到第一融合蛋白；第一融合蛋白中含第一检测蛋白和萤光素酶蛋白片段；S02、构建第二重组质粒，第二重组质粒中含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；将第二重组质粒载体进行过表达，得到第二融合蛋白；第二融合蛋白中含第二检测蛋白和萤光素酶互补蛋白片段；S03、将第一融合蛋白和第二融合蛋白在细胞外孵育，加入萤光素酶底物，观察是否发射萤光，并检测发光强度。

In vitro detection of protein-protein interaction method and detection kit and its application

【技术实现步骤摘要】
体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用
本专利技术属于活性药物筛选
，具体涉及体外检测蛋白间相互作用的方法和检测试剂盒及其应用。
技术介绍
随着生命科学研究的不断发展，通过蛋白与蛋白间的相互作用在生物学上的功能逐渐被发现出来，蛋白间的相互作用能影响细胞的活性，部分蛋白间的相互作用对生物体保持正常功能和状态有着决定性的影响，甚至可用来解释和预测各种生命过程及现象。近年来，通过检测蛋白间的相互作用来辅助新药研发，已经成为相关研究工作者关注的焦点。目前，对蛋白与蛋白间的相互作用的检测与分析方法包括：酵母双杂交系统、串联亲和纯化技术、凝胶过滤层析、酶联免疫吸附试验、表面等离子体共振、等温量热滴定和萤光共振能量转移技术等，这些方法都能较好地检测蛋白与蛋白间的相互作用。但这些方法或检测时间较长，或需要昂贵的专用科学仪器，或需要购买较多的费用不菲的材料。因而，一种简单实用、高效灵敏且时间与费用花费较少的检测方法是目前亟需的。Promega公司开发了使用萤光素酶开发了一种产品NanoBiT，利用双分子萤光互补系统在细胞内检测蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外检测蛋白间相互作用的方法，其特征在于，在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：/nS01、构建第一重组质粒，所述第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第一重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第一融合蛋白；/n所述第一融合蛋白中含所述第一检测蛋白基因表达的第一检测蛋白，以及所述萤光素酶基因片段表达的萤光素酶蛋白片段；/nS02、构建第二重组质粒，所述第二重组质粒中包含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第二重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第二融合蛋白；/n所述第二融合蛋白中含所述第二检测蛋白基因表达...

【技术特征摘要】
1.一种体外检测蛋白间相互作用的方法，其特征在于，在细胞外采用双分子萤光互补技术进行检测，包括：
S01、构建第一重组质粒，所述第一重组质粒中包含第一检测蛋白基因、萤光素酶基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第一重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第一融合蛋白；
所述第一融合蛋白中含所述第一检测蛋白基因表达的第一检测蛋白，以及所述萤光素酶基因片段表达的萤光素酶蛋白片段；
S02、构建第二重组质粒，所述第二重组质粒中包含第二检测蛋白基因、萤光素酶互补基因片段和蛋白纯化标签基因；然后，将所述第二重组质粒载体进行过表达，纯化，得到第二融合蛋白；
所述第二融合蛋白中含所述第二检测蛋白基因表达的第二检测蛋白，以及所述萤光素酶互补基因片段表达的萤光素酶互补蛋白片段；所述萤光素酶互补蛋白片段与所述萤光素酶蛋白片段互补结合，能够形成一个完整的且能催化萤光素酶底物发光的萤光素酶；
S03、将所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白在细胞外孵育，加入所述萤光素酶底物，检测萤光发射情况；
当出现萤光发射现象时，指示所述第一检测蛋白与所述第二检测蛋白之间存在相互作用；当没有出现萤光发射现象时，指示所述第一检测蛋白与所述第二检测蛋白之间不存在相互作用。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萤光素酶基因片段包含序列SEQIDNO.1，所述萤光素酶基因互补片段包含序列SEQIDNO.2；或，所述萤光素酶基因片段包含序列SEQIDNO.2，所述萤光素酶基因互补片段包含序列SEQIDNO.1。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一检测蛋白基因为包含序列SEQIDNO.3的枯草芽孢杆菌nusB基因；
所述第二检测蛋白基因为包含序列SEQIDNO.4的枯草芽孢杆菌nusE基因。


4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述构建第一重组质粒的方法包括：提供质粒载体和寡聚核苷酸接头片段，采用限制性内切酶对所述质粒载体进行酶切形成酶切片段，并将所述寡聚核苷酸接头片段连接所述酶切片段，所述寡聚核苷酸接头片段含有至少一个限制酶内切位点；扩增萤光素酶基因片段，将所述萤光素酶基因片段从所述限制酶内切位点插入所述质粒载体；扩增所述第一检测蛋白基因片段，将所述第一检测蛋白基因片段从所述限制酶内切位点插入所述质粒载体；
所述构建第二重组质粒的方法包括：提供质粒载体和寡聚核苷酸接头片段，采用限制性内切酶对所述质粒载体进行酶切形成酶切片段，并将所述寡聚核苷酸接头片段连接所述酶切片段，所述寡聚核苷酸接头片段含有至少一个限制酶内切位点；扩增萤光素酶互补基因片段，将所述萤光素酶互补基因片段从所述限制酶内...

【专利技术属性】
技术研发人员：马聪，
申请(专利权)人：香港理工大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44