有机氯农药DDT核酸适体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了有机氯农药DDT核酸适体，包括DDT‑01至17中的至少之一，其中，DDT‑01至17依次具有如SEQ ID NO.01至17所示的序列。本发明专利技术的核酸适体能够高特异性识别和高亲和性结合DDT，可应用于检测有机氯农药DDT的相关方法中，在动物体及水体中残留的DDT的检测方面以及在降低DDT对人体的侵害方面具有重要意义。

Aptamer of organochlorine pesticide DDT and its application

【技术实现步骤摘要】
有机氯农药DDT核酸适体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及有机氯农药DDT核酸适体及其应用。
技术介绍
有机氯农药滴滴涕(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)由于其广谱、高效、低廉的特点曾经在世界范围内被大规模使用，但其在自然界中极难分解，对人类健康和生态安全造成的威胁是长期的，研究结果发现DDT及其代谢产物能够诱导不同类型的细胞凋亡，导致机体对癌症的易感性增加。从1970-1980年起，全球开始全面禁止使用DDT杀虫剂，我国也于1983年开始停止生产和使用这类有机氯农药，但是近年的调查发现，在我国的食品中依然能够检测到残留的DDT，且平均值远远高于其他的发达国家。由于食物链的积累作用导致动物性食品的残留量要高于植物性食品。目前DDT及其代谢产物的检测方法为气相色谱法，此方法样品前处理复杂，所需仪器昂贵，不适应大量样品的分析检测。因此，如何快速、准确、灵敏地检测出DDT，防患于未然已成为亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种有机氯农药DDT核酸适体。本专利技术的另一目的在于提供上述核酸适体的应用。本专利技术的技术方案如下：有机氯农药DDT核酸适体，包括DDT-01至17中的至少之一，其中，DDT-01至17依次具有如SEQIDNO.01至17所示的序列。在本专利技术的一个优选实施方案中，为DDT-01至17中的至少之一。进一步优选的，其5’端具有如SEQIDNO.18所示的序列。进一步优选的，其3’端具有如SEQIDNO.19所示的序列。进一步优选的，其5’端具有如SEQIDNO.18所示的序列，其3’端具有如SEQIDNO.19所示的序列。本专利技术的另一技术方案如下：上述有机氯农药DDT核酸适体在检测有机氯农药DDT中的应用。在本专利技术的一个优选实施方案中，采用SGI染料法或纳米金法。本专利技术的再一技术方案如下：一种检测有机氯农药DDT的方法，使用上述有机氯农药DDT核酸适体。在本专利技术的一个优选实施方案中，其为SGI染料法或纳米金法。本专利技术的又一技术方案如下：一种用于检测有机氯农药DDT的生物传感器，具有上述有机氯农药DDT核酸适体。本专利技术的有益效果是：本专利技术的核酸适体能够高特异性识别和高亲和性结合DDT，可应用于检测有机氯农药DDT的相关方法中，在动物体及水体中残留的DDT的检测方面以及在降低DDT对人体的侵害方面具有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1中的DDT筛选采用的技术方法示意图。图2为本专利技术实施例1中核酸适体筛选过程某一轮的qPCR监测结果。图中：Elutingwithsoaking：靶标洗脱产物的扩增曲线；Washingwithsoaking：对照buffer洗涤产物的扩增曲线；图3为本专利技术实施例2中的单克隆PCR鉴定结果。图中：箭头指示用于对应的克隆为阳性克隆。图4为本专利技术实施例2中的核酸适体DDT-01至DDT-04的二级结构预测结果图。图5为本专利技术实施例2中的核酸适体DDT-05至DDT-08的二级结构预测结果图。图6为本专利技术实施例2中的核酸适体DDT-09至DDT-12的二级结构预测结果图图7为本专利技术实施例2中的核酸适体DDT-13至DDT-16的二级结构预测结果图。图8为本专利技术实施例2中的核酸适体DDT-17的二级结构预测结果。图9为本专利技术实施例3中的核酸适体的初步表征结果。图10为本专利技术实施例3中的代表性核酸适体的Kd值计算曲线。图11为本专利技术实施例4中的采用的纳米金法检测核酸适体的灵敏度。图中：A为纳米金检测法原理图；B为随着DDT浓度的增加，纳米金法信号的响应变化。图12为本专利技术实施例5中用纳米金法和SGI法对核酸适体的特异性分析。图中：A为纳米金法检测特异性结果；B为SGI法检测特异性结果。图13为本专利技术实施例6中的核酸适体在实际水体样品中的功能性分析。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1DDT核酸适体的筛选如图1所示，本实施例采用SELEX技术，通过固定文库，利用靶标洗脱的方式进行核酸适体筛选，具体如下：一、核酸文库与基质(SA琼脂糖磁珠)的固定采用生工公司合成的ssDNA核酸适体文库，文库信息为5’-TCCAGCACTCCACGCATAAC(SEQIDNO.18)(Nn)GTTATGCGTGCGACGGTGAA(SEQIDNO.19)-3’，其中n＝20-60，优选为n＝40；第一轮筛选时，将1OD文库溶解于260μLBindingbuffer(1mMCaCl2，2.5mMKCl，1.5mMKH2PO4，0.5mMMgCl2*6H2O，137mMNaCl，8mMNa2HPO4，pH7.2)中，随后和2倍浓度的含Biotin修饰的上游引物固定序列(5’-GTTATGCGTGGAGTGCTGGA-C6-Biotin-3’，SEQIDNO.20)，于PCR仪上进行退火杂交，退火程序为95℃10min；随后以1℃/10s的速率降到60℃，60℃维持1min，随后继续以1℃/10s的速率降到25℃，完成退火。利用SA琼脂糖磁珠(上海英芮诚)与退火产物进行孵育30min，用Bindingbuffer洗涤6次后，完成核酸文库与基质(SA琼脂糖磁珠)的固定。第二轮及随后的筛选，文库浓度调整为700nM(200μL)，磁珠用量相应调整为70μL。二、靶标DDT的筛选及文库富集监测文库固定后，添加靶标DDT(10μMinBindingbuffer)室温筛选30min，随后磁分离收集洗涤上清；和文库固定时的洗涤上清一起进行采用EvaGreen染料的实时荧光定量PCR扩增，分析靶标洗脱效果，根据文库量的变化来监测筛选的进程(图2)。三、核酸适体文库(ssDNA)的PCR1、95℃预热PCR仪；2、将200μL含ssDNA的洗脱液，加入到总体系为2mL的PCRmixed中，随后加入8mL的乳浊液(50mLEM90oil含1mLEM90，25μLtritonX-100以及49mLmineraloil)，充分涡旋混匀后，进行扩增。正向扩增引物序列为5’-TCCAGCACTCCACGCATAAC-3’，反向扩增引物序列为5’-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO.21)-Spacer18-TTCACCGTCGCACGCATAAC(SEQIDNO.22)-3’。3、在PCR仪中按以下程序扩增预变性：95℃5min；10-25个循环：95℃60s，60℃60s，72℃60s；后扩增：72℃5min。四、次级配体库的回收、纯化将PCR产物破乳及正丁醇浓缩后，随后经浓缩后的产物进行8％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：包括DDT-01至17中的至少之一，其中，DDT-01至17依次具有如SEQ ID NO.01至17所示的序列。/n

【技术特征摘要】
1.有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：包括DDT-01至17中的至少之一，其中，DDT-01至17依次具有如SEQIDNO.01至17所示的序列。


2.如权利要求1所述的有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：为DDT-01至17中的至少之一。


3.如权利要求1或2所述的有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：其5’端具有如SEQIDNO.18所示的序列。


4.如权利要求1或2所述的有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：其3’端具有如SEQIDNO.19所示的序列。


5.如权利要求1或2所述的有机氯农药DDT核酸适体，其特征在于：其5’端具有如SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：林俊生，张伟，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建;35