一种人尿液外泌体核酸提取方法技术

一种人尿液外泌体核酸提取方法，尿液外泌体的提取：收集晨尿样本，首先离心去除尿沉渣，再将上清液加入离心过滤管，去除大于0.22μm的成分，再将上清加入已处理好的超滤管中，离心浓缩尿液外泌体；PBS缓冲液对浓缩后的尿液外泌体进行洗涤一次，离心再次浓缩尿液外泌体，洗涤膜表面，收集液体即为尿液外泌体；尿液外泌体核酸的提取：上一步骤分离得到的尿液外泌体，直接进行核酸提取，得到高质量的核酸样本。提取过程经过裂解、洗涤、洗脱步骤，可进行手工法操作，也可进行仪器法操作。本发明专利技术克服了现有技术的不足，整个提取操作过程操作时间短、无毒性、可实现自动化和高通量，且核酸样本得率较高、纯度较好，易于后续在临床广泛应用。

A method of extracting nucleic acid from human urinary exosomes

【技术实现步骤摘要】
一种人尿液外泌体核酸提取方法
本专利技术涉及外泌体核酸提取
，具体涉及一种人尿液外泌体核酸提取方法。
技术介绍
外泌体，是一类由细胞分泌的30-150nm的小囊泡，除了可一定程度调控生物学过程外，其内部更携带了大量核酸（mRNA、microRNA等）和蛋白质。近年来随着其在多种疾病领域内研究的深入，发现外泌体可广泛应用于多种疾病的诊断和治疗，对其内容物的检测在液态活检中具有重要的发展前景。应用外泌体对疾病进行诊断，具有较好的准确性，样本来源广泛且取样方便、可达到无创，应用范围广泛，具有极高的潜能和价值。尿液作为临床上常用的检测样本，其易于获得且样本量较大，可更好的实现尤其是泌尿系统疾病的无创诊断，用于疾病早期筛查或复发监测。对尿液外泌体的分离及核酸提取，是后续有效诊断疾病的基础。对于尿液外泌体分离技术，目前外泌体的提取专利、文献相关报道较多，主要集中于高速离心法、磁珠法、旋转超滤法、超滤法、冻干技术或冻干和磁珠法相结合等。尿液样本具有体积较大、外泌体浓度较低的特点。对于尿液外泌体的提取，大多数已有方法采用的是耗时较长、需特殊离心设本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1）尿液外泌体的提取：/n1.1）收集晨尿样本；/n1.2） 取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；/n1.3）取离心后的上清液加入过滤离心管的内管中，70-100g离心3-10min；使液体全部流入下层外管；/n1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，再将超滤管放置于离心机中3000-4000g 离心15-45min；/n1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入1-5mL PBS缓冲液，混匀后，再次3000-4000g离心15-45min，进行超滤浓缩；/n1.6...

【技术特征摘要】
1.一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）尿液外泌体的提取：
1.1）收集晨尿样本；
1.2）取所收集的样本于离心管中，涡旋混匀，2000-3000g离心3-8min；
1.3）取离心后的上清液加入过滤离心管的内管中，70-100g离心3-10min；使液体全部流入下层外管；
1.4）取出过滤离心管的内管，将下层液体转移到已处理好的超滤管内管中，再将超滤管放置于离心机中3000-4000g离心15-45min；
1.5）倒出超滤管下层外管中的液体，加入1-5mLPBS缓冲液，混匀后，再次3000-4000g离心15-45min，进行超滤浓缩；
1.6）吸取上层内管中的样本至离心管中，即得到尿液外泌体样本；
2）尿液外泌体核酸的提取：
2.1）在离心管中依次加入100-300μL提取所得到的尿液外泌体样本、与样本等体积的裂解液、10-20μL蛋白酶混合液，再加入10μL磁珠悬液和300-350μL异丙醇，进行高速旋涡震荡10-15次，再50℃-70℃孵育15-20分钟，室温放置5分钟；
2.2）将含有磁珠的离心管置于磁力架，颠倒混匀，回收管盖残留磁珠，静置、至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内及管盖液体；且不能将磁珠吸出；
2.3）移去磁力架，向离心管中加入洗涤液以对样本进行充分洗涤，再将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，用移液器吸去管内液体，且不能将磁珠吸出；
2.4）打开离心管盖，于室温干燥2-3分钟，至磁珠表面无明显液体，将待用洗脱液放置于70-90℃预热2-3分钟；
2.5）移去磁力架，加入30-50μL预热好的洗脱液，用枪头吹吸至磁珠分布均匀或高速涡旋10-15次；70℃-90℃孵育5-10分钟，期间每隔1分钟左右摇晃离心管10-15次，使管内磁珠始终保持均匀分布的状态；温育结束后，将离心管高速涡旋10-15次；
2.6）将离心管置于磁力架上，静置直至磁珠全部吸附到管壁，吸取上清到一个无核酶干净的离心管中，即得到纯化后的核酸溶液。


2.根据权利要求1所述的一种人尿液外泌体核酸提取方法，其特征在于：在步骤1.4）之前对于超滤管的预处理步骤为：在超滤管的内管中加入5-10mL无菌水，2-6℃放置5-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：田薇，宋军，黄旭元，周洵，
申请(专利权)人：上海纽思格生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31