以高收率分离RNA的方法技术

本文提供了一种从样品中分离核酸的无苯酚方法，所述方法包括以下步骤：a)向样品添加沉淀缓冲液以制备酸性沉淀混合物，其中所述沉淀缓冲液包含金属阳离子沉淀剂和缓冲剂、pH值为4.0或更低并且不包含选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，并且其中所述酸性沉淀混合物包含浓度小于200mM的金属阳离子沉淀剂，并沉淀蛋白质；b)将沉淀物与上清液分离，其中上清液包含长度小于200nt的小RNA和长度为至少1000nt的大RNA；以及c)从上清液中分离核酸。本方法可以避免在蛋白质沉淀期间使用有机溶剂。还提供了一种沉淀缓冲液。

Separation of RNA with high yield

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】以高收率分离RNA的方法本专利技术涉及一种从样品中分离核酸例如RNA的方法，并且特别地提供了通过使用无苯酚RNA分离法，从各种样品、包括富蛋白质的样品中以高收率有效地分离小RNA和大RNA的手段。对来自各种组织、体液和其他生物样品中的200个核苷酸或更少级别的小核酸的研究是一个极为受关注的领域并且未来有望继续保持。小核酸特别包括但不限于小RNA，例如，尤其是微小RNA(miRNA)和小干扰RNA分子，它们两个都可以对基因表达具有强大影响。此外，参与mRNA和rRNA加工的其他核小RNA和核仁小RNA(例如snRNA和snoRNA)也受到关注。此外，诸如长度为500个核苷酸或更少的RNA之类的核酸也经常作为降解产物包含在其他样品中，并且必须从中有效捕获。随着对各个小RNA的兴趣日益增加，标准分离程序已经得到了修正，以促进小核酸的分离和改善小核酸的收率。这样的改进是必要的，因为用于分离总RNA的标准方案通常对于分离小RNA不理想，原因在于使用标准方法往往无法有效结合小RNA。因此，使用标准程序分离的总RNA通常不包含足量的小RNA用于后续分析。这些低收率可归因于小RNA在核本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种从样品中分离核酸的无苯酚方法，所述方法包括以下步骤：/na)向样品添加沉淀缓冲液以制备酸性沉淀混合物，/n其中所述沉淀缓冲液包含金属阳离子沉淀剂和缓冲剂，pH值为4.0或更低，并且不包含选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，并且/n其中所述酸性沉淀混合物包含浓度小于200mM的金属阳离子沉淀剂，/n并沉淀蛋白质；/nb)将沉淀物与上清液分离，其中所述上清液包含长度小于200nt的小RNA和长度为至少1000nt的大RNA；以及/nc)从所述上清液中分离核酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从样品中分离核酸的无苯酚方法，所述方法包括以下步骤：
a)向样品添加沉淀缓冲液以制备酸性沉淀混合物，
其中所述沉淀缓冲液包含金属阳离子沉淀剂和缓冲剂，pH值为4.0或更低，并且不包含选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，并且
其中所述酸性沉淀混合物包含浓度小于200mM的金属阳离子沉淀剂，
并沉淀蛋白质；
b)将沉淀物与上清液分离，其中所述上清液包含长度小于200nt的小RNA和长度为至少1000nt的大RNA；以及
c)从所述上清液中分离核酸。


2.权利要求1的方法，其中所述金属阳离子沉淀剂选自Zn2+、Cu2+和Al3+，优选Zn2+。


3.权利要求1或2的方法，其具有以下特征中的一个或多个：
i)步骤a)中提供的沉淀混合物包含浓度为175mM或更低、170mM或更低、165mM或更低、160mM或更低、155mM或更低、150mM或更低、145mM或更低或者140mM或更低的所述金属阳离子沉淀剂；
ii)步骤a)中提供的沉淀混合物包含浓度为至少50mM、至少60mM、至少65mM、至少70mM、至少75mM、至少80mM、至少85mM、至少90mM、至少95mM或至少100mM的所述金属阳离子沉淀剂；
iii)步骤a)中提供的沉淀混合物包含浓度选自50mM至175mM、60mM至170mM、65mM至165mM、70mM至160mM、75mM至155mM、80mM至150mM、85mM至145mM、和90mM至140mM的所述金属阳离子沉淀剂；和/或
iv)所述沉淀缓冲液包含所述金属阳离子沉淀剂的溶解盐，优选ZnCl2。


4.权利要求1至3中一项或多项的方法，其中所述沉淀缓冲液包含浓度选自250mM至3M、500mM至2.8M、0.75M至2.7M、1M至2.6M、1.25M至2.5M、1.5M至2.25M和1.7M至2M的所述金属阳离子沉淀剂。


5.权利要求1至4中一项或多项的方法，其中所述沉淀缓冲液是水溶液，所述水溶液的pH值选自2.5至4、2.75至4.0、2.8至4.0、3.0至4.0、3.1至3.9、3.2至3.9、3.3至3.9、3.4至3.9、3.5至3.9和3.5至3.8。


6.权利要求1至4中一项或多项的方法，其中所述沉淀缓冲液是水溶液，所述水溶液
(i)包含浓度在1M至3M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.0至4.0的范围内，或
(ii)包含浓度在1.25M至2.5M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.3至3.9的范围内，或
(iii)包含浓度在1.5M至2.25M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.4至3.9的范围内，或
(iv)包含浓度在1M至3M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.5至3.9的范围内，或
(v)包含浓度在1.7M至2.1M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.0至4.0的范围内，或
(vi)包含浓度在1.7M至2.1M范围内的所述金属阳离子沉淀剂并且pH值在3.5至3.9的范围内。


7.权利要求1至6中一项或多项的方法，其中待分离的核酸是RNA并且其中步骤c)包括从所述上清液中分离至少小RNA和/或大RNA。


8.权利要求7的方法，其中在步骤c)中使用核酸结合固相来分离RNA并且其中使用至少一种醇和/或至少一种离液盐来建立RNA结合条件。


9.权利要求1至8中一项或多项的方法，其中步骤c)包括：
aa)向所述上清液添加至少一种醇以提供包含浓度为≥35％(v/v)、≥40％(v/v)或≥45％(v/v)的醇的结合混合物；
bb)使所述结合混合物中含有的至少大RNA和小RNA与含硅的核酸结合固相结合，其中在步骤bb)之后，至少大RNA和小RNA与所述固相结合；
cc)任选地洗涤结合的RNA；和
dd)任选地从所述固相洗脱RNA。


10.权利要求1至9中一项或多项的方法，其中步骤c)包括向所述上清液添加醇以准备结合条件，其中所述醇优选选自异丙醇和乙醇，并且更优选是异丙醇。


11.权利要求9的方法，其中所提供的结合混合物包含浓度选自35％(v/v)至70％(v/v)、40％(v/v)至65％(v/v)、45％(v/v)至60％(v/v)和45％(v/v)至55％(v/v)的乙醇和/或异丙醇，优选异丙醇。


12.权利要求1至11中一项或多项的方法，其中样品破坏发生在添加所述沉淀缓冲液之前和/或制备所述沉淀混合物的同时/同阶段。


13.权利要求1至12中一项或多项的方法，其中所述方法包括
x)破坏样品；
a)向被破坏的样品添加沉淀缓冲液以制备酸性沉淀混合物，
其中所述沉淀缓冲液包含金属阳离子沉淀剂和缓冲剂，pH值为4.0或更低，并且不包含选自非质子极性溶剂和质子溶剂的有机溶剂，并且
其中所述酸性沉淀混合物包含浓度小于200mM的金属阳离子沉淀剂，
并沉淀蛋白质；
b)将沉淀物与上清液分离，其中所述上清液包含长度小于200nt的...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁·施隆伯格，加布里埃莱·克里斯托弗尔，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE