数字化亲和连接试验制造技术

提供检测样品中的分析物的方法。还提供了进行本文所述方法的试剂盒。

Digital affinity connection test

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】数字化亲和连接试验本申请要求2017年9月27日提交的美国临时申请62/564,029的权益，该申请通过引用整体并入本文。
技术介绍
来自受试者的样品中生物分子的定量可为多种临床应用提供有用的信息。一种检测和定量生物分子例如蛋白质的方法是通过酶联免疫吸附实验(ELISA)。然而，用该实验定量的检测和精确性有限，不足以满足许多需求。替代技术例如免疫-PCR能够提高检测灵敏度，但实际上由于用作检测剂的抗原的非特异性结合而受到高背景信号的问题限制。
技术实现思路
本文描述了用于检测样品中的靶标的方法，组合物和试剂盒。在一个实施方式中，检测样品中的靶标的方法包括：使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性与靶标结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂基于固相载体的存在与否分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂、包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂，其中第一、第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。在某些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：使样品接触包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂，其中第二和第三亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成包含靶标、第二亲和剂和第三亲和剂的第一复合物；使第一复合物和与固相载体连接的第一亲和剂接触，其中第一亲和剂与靶标特异性结合，从而形成包含靶标、第一亲和剂、第二亲和剂和第三亲和剂的靶标-标记的亲和剂复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的组分分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。在一些实施方式中，检测样品中靶标的方法包括：将多个固相载体与包含靶标(如存在)的样品中的多个蛋白偶联，从而形成多个固相载体偶联物，其中靶标包含至少多个蛋白之一；基于多个固相载体存在与否，将多个固相载体偶联物与样品中的未偶联物质分离，从而形成分离的多个固相载体偶联物；使分离的多个固相载体偶联物与包含第一标记物的第一亲和剂以及包含第二标记物的第二亲和剂接触，其中第一和第二亲和剂与靶标特异性结合，从而形成靶标-标记的亲和载体复合物；基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第一和第二亲和剂分离，从而产生分离的靶标-标记的亲和剂复合物；将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。在一些实施方式中，偶联包括交联。在一些实施方式中，分区步骤前从固相载体上切下第一亲和剂，从而从固相载体上释放靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，用序列特异性蛋白酶切下连接第一亲和剂与固相载体的氨基酸标签。在某些实施方式中，蛋白酶是TEV、因子Xa或凝血酶。在一些实施方式中，固相表面和第一亲和剂之间的光可切割的接头通过暴露于光而切割。在一些实施方式中，分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区前，交联靶标-标记的亲和剂复合物。在一些实施方式中，第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。在某些实施方式中，在分区后扩增第一和第二核酸标记物。在一些实施方式中，第一和第二核酸标记物各自用DNA探针(例如TAQMANTM探针、SCORPIONTM探针、ECLIPSETM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针)检测。在某些实施方式中，第一和第二核酸标记物分别用嵌入染料(例如染料)检测。在一些实施方式中，用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。在一些实施方式中，第一标记物是第一荧光团，第二标记物是第二荧光团。在某些实施方式中，第一标记物是第一酶，第二标记物是第二酶，并且检测包括检测第一酶和第二酶产生的产物。在一些实施方式中，第一标记物产生第一信号，第二标记物产生第二信号，第一信号和第二信号可区分。在一些实施方式中，在方法的第一步之前，第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，第二和第三亲和剂用链霉亲和素连接的第一和第二标记物分别标记，使得第一和第二标记的链霉亲和素与各自生物素化的第二和第三亲和剂结合(即通过链霉亲和素-生物素反应)。在一些实施方式中，第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过与生物素化的第一亲和剂结合(即通过链霉亲和素-生物素反应)与第一亲和剂连接。在某些实施方式中，固相载体或多个固相载体是磁珠、非磁性珠、或反应容器表面。在一些实施方式中，非磁性珠是聚苯乙烯珠或硅基珠。在一些实施方式中，固相载体或多个固相载体是磁珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分用磁铁通过吸引靶标-标记的亲和剂复合物中与第一亲和剂连接的磁珠而分离。在某些实施方式中，固相载体或多个固相载体是非磁性珠，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中未复合的组分通过离心分离。在一些实施方式中，固相载体是反应表面，靶标-标记的亲和剂复合物与样品中的未复合组分通过抽吸分离。在某些实施方式中，靶标包含蛋白质、蛋白质聚集物或蛋白质寡聚物。在一些实施方式，靶标是两种或多种相互作用蛋白的复合物，而第二和第三亲和剂各自与复合物中的相互作用蛋白之一结合。在一些实施方式中，其中所述靶标具有重复的相同表位，第一和第二亲和剂或第一和第三亲和剂识别相同表位。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂中的两个或以上识别靶标上的不同表位。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自识别靶标上的不同表位。在一些实施方式中，第一、第二和第三亲和剂各自选自抗体、抗体片段和核酸适体。在一些实施方式中，抗体是单克隆和/或多克隆抗体。在一些实施方式中(例如并行式实施方式中)，靶标是多个不同靶标，第一亲和剂是多种不同的亲和剂，第二亲和剂是多种不同的第二亲和剂，其含有多个第一标记物，且第三亲和剂是多种不同亲和剂，其含有多个第二标签，其中一组第一、第二和第三亲和剂特异性结合于多个不同靶标中的同一个。在某些本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.检测样品中分析物的方法，所述方法包括：/n使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；/n基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；/n使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；/n基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；/n将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和/n通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170927 US 62/564,0291.检测样品中分析物的方法，所述方法包括：
使样品接触与固相载体连接的第一亲和剂，其中第一亲和剂与靶标(如存在)特异性结合，从而形成与第一亲和剂结合的靶标；
基于固相载体的存在与否，将与第一亲和剂结合的靶标与样品中未结合的物质分离，从而产生分离的样品，其包含与第一亲和剂结合的靶标；
使分离的样品与包含第一标记物的第二亲和剂以及包含第二标记物的第三亲和剂接触，其中第二和第三亲和剂特异性结合于靶标，从而形成靶标-标记的亲和剂复合物；
基于固相载体的存在与否，将靶标-标记的亲和剂复合物与未复合的第二和第三亲和剂分离，从而形成分离的靶标-标记的亲和剂复合物；
将至少分离的靶标-标记的亲和剂复合物分到多个分区内；和
通过检测至少同一个分区内第一和第二标记物的存在检测靶标在样品中的存在。


2.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物是第一核酸标记物，第二标记物是第二核酸标记物。


3.如权利要求2所述的方法，其中在分区后扩增第一和第二核酸标记物。


4.如权利要求3所述方法，其中第一和第二核酸标记物各自用嵌入染料或选自TAQMANTM探针、SCORPIONTM探针、ECLIPSETM探针、分子信标探针、双链探针、双重杂交探针或双淬灭探针的DNA探针检测。


5.如权利要求4所述的方法，其中用同一DNA探针或嵌入染料的不同信号水平检测第一和第二核酸标记物。


6.如权利要求1所述的方法，其中第一标记物和第二标记物各自与链霉亲和素连接，第二和第三亲和剂生物素化，和其中在方法的第一步之前，第一和第二链霉亲和素连接的标记物与生物素化的第一和第二亲和剂各自通过链霉亲和素-生物素相互作用偶联。


7.如权利要求1所述的方法，其中第一亲和剂生物素化，固相载体与链霉亲和素连接，其中在方法的第一步前，链霉亲和素连接的固相载体通过链霉亲和素-生物素相互作用与生物素化的第一亲和剂连接。


8.如权利要求1-7任一所述的方法，其中第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·吉尔多，D·舍兹菲，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US