用色原体检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种制造技术

本申请涉及一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使所述样本与(7R)‑7‑[(z)‑2‑(2‑氨基噻唑‑4‑基)‑(Z)‑2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]‑3‑(2，4‑二硝基苯乙烯基)‑3‑头孢烯‑4甲酸)或其盐的溶液反应；以及当在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。

Detection of Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter species producing carbapenem by chromoplasma

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用色原体检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种
本专利技术涉及一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目(Enterobacteriales)、假单胞菌属(Pseudomonas)和不动杆菌属(Acinetobacter)的存在的方法，以及用于这类方法的试剂盒。
技术介绍
碳青霉烯酶是一组对包括碳青霉烯类在内的各种抗生素均具有活性的β-内酰胺酶。碳青霉烯酶属于三类β-内酰胺酶，即Ambler类A、Ambler类B和Ambler类D。这三类碳青霉烯酶使临床上重要的细菌对碳青霉烯类具有耐药性或对碳青霉烯类的降低的敏感性。因此，产碳青霉烯酶的细菌在临床上引起关注，并且需要对其进行早期检测的方法，以防止其传播，并减少多药耐药性和泛药耐药性。在临床上广泛使用两种试验来检测产碳青霉烯酶的细菌；和其他MIC条产品以及“改良Hodge试验”。在中，针对试验微生物的指示剂碳青霉烯和碳青霉烯加酶抑制剂抗菌剂在琼脂上以相反的预定义梯度提供，并用于测定抗菌剂的最小抑菌浓度(MIC)和抑菌浓度比。在“改良Hodge试验”中，当报告细菌朝着含有碳青霉烯的圆盘生长以在圆盘周围产生特征性的“三叶草”生长模式时，检测产碳青霉烯酶的细菌。这种现象可由试验分离株产生的碳青霉烯灭活酶介导。还使用了碳青霉烯酶基因的分子检测技术。然而，这三种试验都有其缺点。和“改良Hodge试验”既不够灵敏，也没有足够的特异性，而分子检测技术复杂且昂贵。此外，所有这三种检测方法都非常耗时，确定样本是否含有产碳青霉烯酶的细菌的典型时间尺度是最多达24小时。这在控制医院获得性感染和耐药性传递时不能令人满意。最近，开发了酸性比色(acido-colorimetric)技术用于检测产碳青霉烯酶的细菌，据报道，与“改良Hodge试验”和分子检测技术相比，所述酸性比色技术显著降低了测定时间。WO2012/175637记载了这样一种方法，其中具体记录了测定时间小于2小时。然而，目前的快速表型试验表明，在样本中检测产碳青霉烯酶的假单胞菌属(Heinrichs等人，2015)和不动杆菌属的灵敏度和特异性较差。特别地，可能获得假阴性。此外，快速检测产碳青霉烯酶的肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是限制这些生物体传播的关键，虽然有表型和分子方法可用于检测这些生物体，但是没有单一的检测方法证明对于所有情况都是理想的(LutgringetLimbago，2016)。根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibilityTesting)(EUCAST，2018)，最近的分类学研究缩窄了肠杆菌科的定义。因此，肠杆菌目是革兰氏阴性菌的一个目，其仅包括一个科；肠杆菌科。因此，本专利技术将参考肠杆菌目。因此，需要提供一种检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其不仅具有高度的特异性和灵敏度，而且还可易于在临床上应用。
技术实现思路
本专利技术人发现，通过使用产色头孢菌素(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐进行表型试验，可以在非常短的时间内检测到产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在。具体地，本专利技术人发现的检测方法不需要在测试碳青霉烯酶的存在之前，将分离株预先暴露于任何可能诱导或抑制表达的试剂，这因此需要额外的信息期。在一个方面，本专利技术人已发现可以使用产色头孢菌素(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐检测来自怀疑感染了产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的患者的样本中这类细菌的存在。因此，在第一方面，本专利技术提供一种用于检测来自患者的样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的溶液反应；以及检测反应介质的颜色变化，其中颜色从黄色变到红色表明试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属。根据第二方面，本专利技术提供(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的用途。根据第三方面，本专利技术还提供一种用于测定微生物是否产生水解碳青霉烯的β-内酰胺酶的试剂盒，其包括浸渍有(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐，和超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物的测定盘。本专利技术还涉及一种微量滴定板，其包含一个孔或一系列孔，所述孔含有(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐，以及其在检测试验样本中碳青霉烯酶生产者的存在中的用途。此外，本专利技术还涉及包含(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的小瓶或微量离心管，以及其在检测试验样本中碳青霉烯酶生产者的存在中的用途。具体实施方式需要可以快速检测产碳青霉烯酶的细菌的方法，以便采取必要的行动来防止抗生素耐药性的传播，并保持抗生素如青霉烯类和碳青霉烯类的功效。本专利技术的方法通过向用户提供以快速且可靠的方式测定样本是否含有产碳青霉烯酶的细菌的可解释结果来解决这一需要。具体地，该方法可适合于提供快速且可靠的表型试验，用于检测产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属种的存在。因此，本专利技术有利地提供一种适合于提供快速且可靠的表型试验的方法，用于检测不可快速且可靠地使用其他已知方法和/或试验进行测试的产碳青霉烯酶的细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的存在。因此，在第一方面，本专利技术提供一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；使样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸或其盐的溶液反应；以及当试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。本专利技术的方法对于检测肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：/n提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；/n使所述样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的溶液反应；以及/n当在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170807 GB 1712671.51.一种用于检测样本中产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属和不动杆菌属的存在的方法，其包括：
提供怀疑具有产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属的样本；
使所述样本与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的溶液反应；以及
当在试验样本中存在产碳青霉烯酶的肠杆菌目、假单胞菌属或不动杆菌属时，检测反应介质的颜色变化。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样本为生物样本。


3.根据权利要求2所述的方法，其中所述生物样本选自诸如尿液的生物样本或通常来自分离的细胞培养物。


4.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包括在与(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐反应之前或同时将所述样本裂解的步骤。


5.根据权利要求1至3所述的方法，其中样本裂解在(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的存在下发生。


6.根据权利要求5所述的方法，其中所述样本裂解通过多粘菌素、糖肽和多肽抗生素的组合促进。


7.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述样本与([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的反应在足以观察颜色变化的时间内、优选在小于1小时内、更优选在小于30分钟内且最优选在约5至约20分钟内进行。


8.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述样本与([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4-二硝基苯乙烯基)-3-头孢烯-4甲酸)或其盐的反应在约5℃至约40℃的温度下、更优选在约20℃至约37℃的温度下且最优选在35℃下进行。


9.根据上述任一权利要求所述的方法，其中所述方法还包括超广谱β-内酰胺(ESBL)抑制剂、AmpC抑制剂或其混合物。


10.根据上述任一权利要求所述的方法，其中([(7R)-7-[(z)-2-(2-氨基噻唑-4-基)-(Z)-2(甲氧基亚氨基)乙酰胺]-3-(2，4...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·A·霍布森，M·M·科尔博恩，M·戴维斯，A·C·安雅科沃，
申请(专利权)人：马斯特集团有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB