检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒技术

本发明专利技术公开了用于检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒，均涉及检测RBM5基因表达水平的引物RBM5‑F、RBM5‑R，探针RBM5‑Probe；检测内参基因Actin的引物Actin‑F，Actin‑R，探针Actin‑Probe。该引物和探针经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。本发明专利技术可快速检测样本中存在的RBM5基因及其表达量的多少，可为肺癌患者辅助制定个体化治疗方案和疾病预后判断。

Methods, primers, probes and kits for detecting the relative expression of rbm5 gene

【技术实现步骤摘要】
检测RBM5基因相对表达量的方法、引物和探针以及试剂盒
本专利技术属于生命科学和生物
，特别涉及一种用于检测RBM5基因相对表达量的引物、探针、方法和试剂盒，采用荧光PCR技术，用于检测肿瘤患者体内RBM5基因的表达水平。
技术介绍
肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中80％～85％的病例为肺小细胞肺癌(NSCLC)。据统计，在欧洲，每年新发病例超过20万，其中死亡人数占所有癌症相关死亡的20％。在美国，每年约有15万患者死于肺癌。在中国大陆，肺癌的发病率和病死率均呈显著升高的趋势。尽管诊断手段，外科手术、化疗药物及放疗方法不断更新、发展，但在过去的30年里肺癌的5年生存率仍然只有13％～15％。吸烟是是肺癌的一个重要的危险因子，85％肺癌患者吸烟。分子学上认为非小细胞肺癌的形成缘于致癌基因的激活及抑癌基因的失活。人类3号染色体短臂2区1带3亚带(3p21.3)缺失是肺癌最常见的基因改变，已证实在95％的小细胞肺癌和50％～80％的非小细胞肺癌的细胞中存在该区域中的基因杂合性缺失，这个区域共有19个基因，这19个基因都在不同程度上表现出了相应的肿瘤抑制作用，RNA结合基序蛋白5(RBM5)位于这19个基因的末端。RBM5主要分布于细胞核，具有识别、结合RNA，参与机体内RNA转录、翻译、基因表达、细胞增殖以及调控细胞周期及凋亡等功能，目前研究证实，RBM5是潜在的肿瘤抑制因子。RBM5基因至少编码4种不同选择性转录体，在调节细胞凋亡，尤其是在调节肿瘤细胞凋亡中起到重要作用。针对这个基因的结构、功能、肿瘤抑制机制的研究可能有助于人们在未来开发出诊断和治疗人类肿瘤的新方法。检测RBM5等基因表达水平的常用技术有荧光原位杂交技术(FISH)、实时定量PCR技术(RQ-PCR)等方法。FISH检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。实时荧光定量PCR中常见的方法有SYBRGreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBRGreenI由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及Taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。在Taqman技术中，RQ-PCR采用Taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对PCR产物的准确定量，易于统一标准，与定性PCR技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点。
技术实现思路
鉴于现有技术中检测RBM5基因的不足，本专利技术设计了检测内参与目的基因的引物、探针序列，采用荧光定量PCR技术检测RBM5两种基因相对表达量。通过调整引物和探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，可使扩增效率和速率均达到最佳。本专利技术提供了用于检测样本中RBM5基因相对表达量的引物和探针，所述引物和探针包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAARBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCATRBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。优选地，所述引物和探针还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCAActin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAAActin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。优选地，RBM5-F、RBM5-R和RBM5-Probe的摩尔比为1:1:1。优选地，Actin-F、Actin-R和Actin-Probe的摩尔比为1:1:1。本专利技术还提供了一种检测样本中RBM5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算RBM5基因相对表达量，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe以及检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAARBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCATRBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA；Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCAActin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAAActin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。本专利技术还提供了一种检测样本中RBM5基因相对表达量的试剂盒，所述试剂盒包括检测体系PCR反应液，其特征在于，所述检测体系PCR反应液包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAARBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCATRBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。优选地，所述检测体系PCR反应液还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCAActin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAAActin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。优选地，所述试剂盒还包括阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其特征在于，所述阳性对照品为含有RBM5cDNA序列的阳性质粒溶液，所述阴性对照品为不含有RBM5cDNA序列的质粒溶液，所述空白对照品为生理盐水或不加任何物质。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便，有助于检测人类肿瘤患者体内RBM5基因微量残留，对于及时干预治疗避免血液学复发、调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术将实时荧光PCR技术结合采用Taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测样本中RBM5基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：/nRBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA/nRBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT/nRBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测样本中RBM5基因相对表达量的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针包括检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe，其碱基序列如下所示：
RBM5-F：TCTCAGACCTTCACAAGCAAA
RBM5-R：GCTCGGTCTCGGTATTTCAT
RBM5-Probe：FAM-TGGACATCTATCGACGATCCAGGCTGA-TAMRA。


2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，所述引物和探针还包括检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe，其碱基序列如下所示：
Actin-F：GATACGAAGGGAGGGTGTACCA
Actin-R：CTCGGCCAGGGTGTTGAA
Actin-Probe：FAM-GCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTCCT-TAMRA。


3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，RBM5-F、RBM5-R和RBM5-Probe的摩尔比为1:1:1。


4.如权利要求2所述引物和探针，其特征在于，Actin-F、Actin-R和Actin-Probe的摩尔比为1:1:1。


5.一种检测样本中RBM5基因相对表达量的方法，所述方法包括以下步骤：(1)提取样本中的RNA；(2)将步骤(1)中的RNA逆转录cDNA；(3)利用荧光PCR扩增步骤(2)所述的cDNA，并计算RBM5基因相对表达量，其特征在于，步骤(3)中的荧光PCR扩增是在检测RBM5基因的上游引物RBM5-F、下游引物RBM5-R、探针RBM5-Probe以及检测内参基因Actin的上游引物Actin-F、下游引物Actin-R、探针Actin-Probe的存在下进行的，其碱基序列如下所述：
RB...

【专利技术属性】
技术研发人员：李允章，刘赵玲，王淑一，
申请(专利权)人：武汉艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42