一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPT Ⅱ的重组质粒、重组菌及应用，属于基因工程育种技术领域；所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPT Ⅱ。本发明专利技术将四个虾青素合成关键酶基因用2A短肽序列连接，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。另外，本发明专利技术的重组质粒中删除了筛选标记基因NPT Ⅱ，增加了重组质粒用于转基因的安全性。

A recombinant plasmid including astaxanthin synthetase fusion gene and non screening marker gene NPT \u2161, recombinant bacteria and its application

【技术实现步骤摘要】
一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用
本专利技术涉及基因工程育种
，尤其涉及一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用。
技术介绍
虾青素是一种分子结构独特的红色酯溶性酮式类胡萝卜素，具有极强的抗氧化活性以及抗辐射，抗衰老、抗肿瘤和预防心血管等疾病的功能。虾青素的生物合成只发生于少量细菌和绿藻中，且产量很低；植物中也只有夏侧金盏花(Adonisaestivalis)可以在其花瓣中合成微量的虾青素。由于虾青素的自然资源有限，科学家们都在通过基因工程方法寻求不同的植物来生产更高产量的天然虾青素，并在莴苣、马铃薯、小麦、油菜、烟草、番茄和水稻等植物中获得成功。但在这些转基因植物中经常使用潮霉素抗性基因(HPT)、卡那霉素抗性基因(NPTⅡ)和草丁膦抗性基因(BAR)等抗性标记基因筛选以获得成功转化的细胞。由于这些抗性基因存在对食品和生态环境的潜在危害，已经成为影响转基因植物商品化应用的主要障碍，当务之急是培育出不含抗性标记基因、安全的能生产虾青素的转基因植物。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒、重组菌及应用，该重组质粒、重组菌能够用于培育不含抗性标记基因NPTⅡ的转基因植物。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。优选的，所述重组质粒以Napin启动子作为启动子。本专利技术提供了一种包括上述方案所述重组质粒的重组菌。本专利技术提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。本专利技术提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用。优选的，所述类胡萝卜素包括虾青素。优选的，所述类胡萝卜素还包括新黄质、酮式叶黄素、虾青素、叶黄素、酯化叶黄素、叶绿素、隐黄质、海胆酮、番茄红素、α-胡萝卜素和/或β胡萝卜素。本专利技术提供了上述方案所述重组质粒或者所述重组菌在提高亚麻荠种子总抗氧化能力中的应用。优选的，所述应用包括以下步骤：将所述重组质粒或者重组菌导入亚麻荠植株，培育，得到亚麻荠种子，从亚麻荠种子中选择颜色为红色的种子，得到目标亚麻荠种子。优选的，所述导入的方法包括农杆菌花序浸染法。本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。本专利技术的虾青素合成酶融合基因包括将虾青素合成途径中的三个关键酶基因以及促进有色体分化与类胡萝卜素储藏的Orange(来自花椰菜)基因，其中三个关键酶基因分别是来自莱茵衣藻的β-胡萝卜素酮化酶(CrBKT)和来自雨生红球藻的羟化酶(HpBHY)基因、八氢番茄红素合成酶(CrtB)基因。本专利技术将四个关键酶基因用2A短肽序列连接，能够简化重组质粒(表达载体)的构建，并实现各基因的协同表达。另外，本专利技术的重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ，增加了重组质粒用于转基因的安全性。通过农杆菌花序浸染法将本专利技术的重组质粒导入亚麻荠植株，得到的亚麻荠转化植株，经检测，亚麻荠转化植株的种子中总类胡萝卜素含量为913.54μg/gDW，是野生型(16.08μg/gDW)的56倍，更为重要的是虾青素含量由0增加至42.72μg/gDW。亚麻荠转化植株种子总抗氧化能力转化株系显著高于野生型。亚麻荠转化植株种子可以直接通过常规物理榨油方式获得亚麻荠籽油，比传统的通过超临界CO2临界萃取的方法简单快捷，且低成本高效率；同时利用本专利技术的重组质粒用于亚麻荠育种，能够获得安全性更高、品质更好的亚麻荠株系，使得转基因亚麻荠产品商品化成为可能。因此，将本专利技术的重组质粒用于亚麻荠育种，并利用亚麻荠生产高品质的、兼具不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的食用油具有极大的商业前景。附图说明图1为本专利技术重组质粒图谱；图2为T0转化成功幼苗和野生型幼苗实物图，其中A为T0转化成功幼苗，B为野生型幼苗；图3为T1代种子和野生型种子实物图，其中A为T1代种子，B为野生型种子；图4为T1代种子色素提取液和野生型种子色素提取液实物图，其中A为T1代种子色素提取液；B为野生型种子色素提取液；图5为T1代株系种子的PCR扩增结果；图6为转化子种子UHPLC色谱图；图7为野生型种子UHPLC色谱图；图8为转化子种子和野生型种子总抗氧化能力分析结果。具体实施方式本专利技术提供了一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，具体为：cccgggacaaagagtaaagaagaacaatggcatcttctatgctgtcttctgcgactatggttgcgtctccggctcaggctactatggtggcaccgttcaacggtctgaagtcctccgcggctttcccggctactcgtaaagcgaacaacgacattaccagcattacctctaacggtggtcgtgtgaactgcatgaacaacccgtctctgctgaaccatgcggtggaaaccatggcggtgggttccaaatccttcgcgaccgcgtctaagctgttcgatgcaaagacccgtcgttctgtgctgatgctgtatgcatggtgccgccattgtgacgacgttatcgacgaccagactctgggcttccaggcacgtcagccggcgctgcagactccggaacagcgtctgatgcagctggagatgaagactcgccaggcttatgcaggctctcagatgcacgaaccggcgttcgctgctttccaggaagttgcgatggcgcatgatatcgctccggcatacgcgtttgatcatctggaaggcttcgctatggacgtgcgcgaggcgcagtactcccagctggacgataccctgcgctactgctaccacgttgctggtgttgtgggcctgatgatggcacagatcatgggtgttcgtgataacgcgaccctggatcgcgcatgtgacctgggtctggcattccagctgactaacattgcgcgtgacattgttgacgatgcgcacgcaggccgttgttatctgccggcgtcttggctggaacacgaaggcctgaacaaagaaaactacgctgcaccggaaaac本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。/n

【技术特征摘要】
1.一种包括虾青素合成酶融合基因、无筛选标记基因NPTⅡ的重组质粒，所述虾青素合成酶融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；所述重组质粒以pBI121作为原始质粒；所述重组质粒中删除了筛选标记基因NPTⅡ。


2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以Napin启动子作为启动子。


3.一种包括权利要求1或2所述重组质粒的重组菌。


4.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求3所述重组菌在亚麻荠育种中的应用。


5.权利要求1或2所述重组质粒或者权利要求3所述重组菌在提高亚麻荠种子中类胡萝卜素的含量中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：何明霞，黄俊潮，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53