一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程、分子生物学等生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法，本培养基可提高大肠杆菌在细胞质内表达可溶性重组蛋白的成功率和产量。所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达。所述高效培养基用于表达重组蛋白，特别是大肠杆菌表达可溶性重组蛋白。本培养基可以用大肠杆菌BL‑21或DH5α菌株作为反应菌，也可以用K12或origami B等大肠杆菌菌株作为反应菌。

An efficient medium for expression of soluble recombinant protein in E.coli and its preparation

【技术实现步骤摘要】
一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法
本专利技术属于基因工程、分子生物学等生物
，具体涉及一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法，本培养基可提高大肠杆菌在细胞质内表达可溶性重组蛋白的成功率和产量。
技术介绍
大肠杆菌（Escherichiacoli）隶属于细菌界、变形菌门、肠杆菌科、埃希氏菌属、大肠杆菌种，是典型的革兰氏阴性菌。因其在自然界分布广泛，结构简单，易培养，繁殖速度快，且遗传背景清晰等特点，已经成为生物学研究中的模式生物之一，广泛应用于基因功能研究、基因表达产物获得等，在遗传学、分子生物学和基因工程领域广泛应用。重组蛋白主要是应用基因重组技术，获得连接有可以翻译成目的蛋白的基因片段的重组载体，令其在宿主细胞中表达目的蛋白的获得的重组蛋白分子。当前重组蛋白的生产主要包括四大系统：原核表达系统、真核表达系统、哺乳动物细胞蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统，也有利用转基因动物的乳腺或者植物产生，产生的重组蛋白作为生物制药的产物，在医学中作用显著。利用基因工程技术，可以使细胞或者动物本身变成“批量生产药物的工厂”。大肠杆菌作为原核表达系统中的代表性菌种，具有众多优势：培养条件简单、成本低廉、易于操作、表达周期短，基因产物表达量高等。目前，大肠杆菌表达系统是目前最为成熟的表达系统，尤其适用于原核来源的基因产物表达或不需要翻译后加工的蛋白表达，在基因工程领域被广泛应用，用以揭秘生命的奥秘。大肠杆菌作为表达外源蛋白的首选表达系统，在表达重组蛋白过程中常经以下三种方式实现：细胞外分泌、周质空间表达以及细胞质内表达。但在研究中发现，细胞质内表达的重组蛋白因易发生新生肽链的集聚沉淀而产生无活性的包涵体，以非可溶形式存在于大肠杆菌细胞液内，需经过复杂的变性、再复性过程才能得到具有活性的外源蛋白。蛋白重新折叠得到的外源蛋白生物活性的未知性及纯化后蛋白的产量下降等现象是目前存在的亟待解决的问题。大肠杆菌培养基、培养条件和培养方式均是影响其生长和目标蛋白表达的主要因素，培养基的组成和配比是否恰当，对菌体的生长、目标蛋白的表达及目标蛋白的复性与分离纯化均有很大影响。在胞内表达、周质空间表达和培养基分泌表达中提高目的蛋白的可溶性是最常采用的策略。因此，通过选择合适的载体和宿主菌、降低重组蛋白合成速率、共表达其它蛋白质、改变培养基的成分等方式可提高外源蛋白的可溶性表达。其中以改变培养基成分是有效的解决途径之一。大肠杆菌表达外源蛋白过程中，广泛使用LB培养基，但LB培养基存在因成分不能完全满足所有待培养物的生长需求，产生表达获得的菌体少，目标蛋白产量低等缺点，不能满足后续研究需要，也不能满足大规模发酵生产需要。目前基于LB培养基，通过添加不同物质配置成M1-M10液体培养基。该类培养基营养成分充沛，细菌能正常快速生长，应用于各类培养，但在原核诱导表达过程中，容易产生葡萄糖效应。即过多的葡萄糖会抑制微生物的生长和产量，乳糖利用率降低，不能正常开启基因的转录而影响后续的翻译合成蛋白。尤其在细菌生长的最佳温度条件下，LB培养基中外源蛋白在原核细胞质内表达易集聚形成包涵体并复性过程较繁杂困难，错误折叠或不能正常形成二硫键都会导致蛋白结构变化而影响蛋白质的生物活性。基于上述大肠杆菌在表达重组蛋白过程中存在的问题，为改善目标蛋白在原核表达过程中的不足，特此针对于原核表达培养基进行优化改良。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的高效培养基，该培养基可促进大肠杆菌通过信号肽向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径，进一步释放到培养基液体中，进而提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的成功率和产量。本专利技术的另一个目的在于提供一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基的制备方法。以下叙述中，以百分号（%）标识的量，该百分数为质量分数。本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达。所述M9培养基的配比如下：配置1L该M9培养基，取750ml无菌去离子水，该去离子水冷至50度或50度以下，加入：5*M9盐溶液200ml1mol/L硫酸镁2ml适当碳源的20%溶液（如20%葡萄糖）20ml1mol/L氯化钙0.1ml灭菌的去离子水定容到1000ml。所述5*M9盐溶液的配制方法如下：SA1：按如下配比配制溶液：Na2HPO4.7H2O64gKH2PO415gNaCL2.5gNH4Cl5.0g用去离子水溶解上述盐，定容至终体积为1L；SA2：将上述1L5*M9盐溶液平均分装成5份，每份200ml，5份5*M9盐溶液均在15psi高压下蒸汽灭菌15min，得第一混合液。所述M9培养基的配制方法如下：SB1：分别配置1mol/L硫酸镁、1mol/L氯化钙溶液，均高压灭菌；SB2：取1份200ml的第一混合液，加入20%葡萄糖20ml，得第二混合液；SB3：用无菌蒸馏水将上一步所得第二混合液稀释至980ml后，加入1mol/L硫酸镁2ml和1mol/L氯化钙0.1ml溶液，无菌蒸馏水定容至1L，用0.22微摩尔滤器过滤灭菌。所述高效培养基的配制方法包括：SC1：配制母液，分别是：（1）50%山梨醇：取500g山梨醇溶于蒸馏水中，补充稀释至1L；过滤灭菌；（2）无水乙醇；（3）80%葡萄糖：取800g葡萄糖溶于蒸馏水中，补充稀释至1L；过滤灭菌；（4）20%蔗糖：取200g蔗糖溶于0.1MPB（PH7.2-7.4）缓冲液中，补充稀释至1L；过滤灭菌；（5）100mMIPTG溶液：取23.83g异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶于少量蒸馏水中，补充稀释至1L，过滤灭菌；（6）50mg/ml氨苄青霉素：过滤灭菌；（7）1-2.5mol/L硫酸镁：高压灭菌；上述母液的七个成份，除第（2）、（6）、（7）成份以外，其他成份所记载的浓度，仅指按照上述方法配制溶液所得的准确浓度或者大概浓度；母液置于室温或四度放置；SC2：配制工作液，具体步骤如下：（1）按重量比分别取如下份量的母液，每1L该高效培养基的工作液中包括：M9培养基100ml50%山梨醇100-160ml无水乙醇50-80ml80%葡萄糖5-10ml20%蔗糖100-250ml1-2.5mol/L硫酸镁1ml50mg/ml氨苄青霉素1-2.5ml100mMIPTG溶液5-8ml；（2）按上述量向M9培养基中依次加入山梨醇、无水乙醇、葡萄糖、蔗糖、硫酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：/n所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达；/n所述M9培养基的配比如下：/n配置1L该M9培养基，取750ml无菌去离子水，该去离子水冷至50度或50度以下，加入：/n5*M9盐溶液 200ml/n1mol/L硫酸镁 2ml/n适当碳源的20% 溶液 20ml/n1mol/L氯化钙 0.1ml/n灭菌的去离子水定容到 1000ml。/n

【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：
所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达；
所述M9培养基的配比如下：
配置1L该M9培养基，取750ml无菌去离子水，该去离子水冷至50度或50度以下，加入：
5*M9盐溶液200ml
1mol/L硫酸镁2ml
适当碳源的20%溶液20ml
1mol/L氯化钙0.1ml
灭菌的去离子水定容到1000ml。


2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：
所述5*M9盐溶液的配制方法如下：
SA1：按如下配比配制溶液：
Na2HPO4·7H2O64g
KH2PO415g
NaCL2.5g
NH4Cl5.0g
用去离子水溶解上述盐，定容至终体积为1L；
SA2：将上述1L5*M9盐溶液平均分装成5份，每份200ml，5份5*M9盐溶液均在15psi高压下蒸汽灭菌15min，得第一混合液。


3.根据权利要求2所述的一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：
所述M9培养基的配制方法如下：
SB1：分别配置1mol/L硫酸镁、1mol/L氯化钙溶液，均高压灭菌；
SB2：取1份200ml的第一混合液，加入20%葡萄糖20ml，得第二混合液；
SB3：用无菌蒸馏水将上一步所得第二混合液稀释至980ml后，加入1mol/L硫酸镁2ml和1mol/L氯化钙0.1ml溶液，无菌蒸馏水定容至1L，用0.22微摩尔滤器过滤灭菌。


4.根据权利要求1或2或3所述的一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：
所述高效培养基的配制方法包括：
SC1：配制母液，分别是：
（1）50%山梨醇：取500g山梨醇溶于蒸馏水中，补充稀释至1L；过滤灭菌；
（2）无水乙醇；
（3）80%葡萄糖：取800g葡萄糖溶于蒸馏水中，补充稀释至1L；过滤灭菌；
（4）20%蔗糖：取200g蔗糖溶于0.1MPB（PH7.2-7.4）缓冲液中，补充稀释至1L；过滤灭菌；
（5）100mMIPTG溶液：取23.83g异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷溶于少量蒸馏水中，补充稀释至1L，过滤灭菌；
（6）50mg/ml氨苄青霉素：过滤灭菌；
（7）1-2.5mol/L硫酸镁：高压灭菌；
上述母液的七个成份，除第（2）、（6）、（7）成份以外，其他成份所记载的浓度，仅指按照上述方法配制溶液所得的准确浓度或者大概浓度；
母液置于室温或四度放置；
SC2：配制工作液，具体步骤如下：
（1）按重量比分别取如下份量的母液，每1L该高效培养基的工作液中包括：
M9培养基100ml
50%山梨醇100-160ml

【专利技术属性】
技术研发人员：邵国，巴德仁贵，鲍牧兰，姜树原，贾小娥，谢伟，谢雅彬，刘晓蕾，许文强，石蕊，
申请(专利权)人：邵国，
类型：发明
国别省市：内蒙;15