一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B，单链单元A和B都包含了单链可变片段(scFv)、人IgG1的铰链区和Fc片段，其中该单链单元A的scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，单链单元B的scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。本发明专利技术还提供了该双特异性抗体的构建方法及其应用。经过小鼠的中和实验，表明该抗体具有中和保护作用，该双特异性抗体可用于作为诊断试剂检测破伤风类毒素抗原的质量，也可以替代破伤风抗毒素、马破伤风免疫球蛋白或人破伤风免疫球蛋白，用于被动免疫。

An all human bispecific antibody against tetanus and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种全人源化抗破伤风双特异性抗体及其构建方法和应用
本专利技术属于生物技术，涉及基因工程
，更具体地，本专利技术公开了一类抗破伤风类毒素的双特异性抗体，尤其涉及一种全人源化抗破伤风双特异性抗体；此外，本专利技术还涉及该全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，以及该全人源化抗破伤风双特异性抗体在破伤风感染后的被动治疗中的应用。
技术介绍
破伤风是由破伤风杆菌入侵创伤而引起的一种特异性感染，其主要致病原是破伤风杆菌产生的破伤风类毒素。破伤风类毒素是一个由1315个氨基酸组成的分子量约为150kDa的蛋白。该多肽在破伤风杆菌的蛋白水解酶作用后，在456和467氨基酸残基之间裂解成为分量大约为50KD轻链（LC）和100KD重链(LN)，LC和LN通过一对二硫键S439-S467连接。LC是锌依赖蛋白酶，在193-197位有一个锌指结合蛋白的功能域HELIH，375位的酪氨酸是一个催化活性位点。在864和863之间有一个木瓜蛋白酶(papin)切位点可以将重链进一步降解为N端（HCN）和C端（HCC或TTC）。HCN负责突触囊泡通过细胞质进入细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B；单链单元A称为A链，单链单元B称为B链，A链和B链均为融合肽，融合肽的基本结构包含单链可变片段scFv、铰链区和Fc片段；A链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，B链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。/n

【技术特征摘要】
1.一种全人源化抗破伤风双特异性抗体，其特征在于，该双特异性抗体包括单链单元A和单链单元B；单链单元A称为A链，单链单元B称为B链，A链和B链均为融合肽，融合肽的基本结构包含单链可变片段scFv、铰链区和Fc片段；A链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Trp1289为中心的区域具有特异性结合能力，B链的单链可变片段scFv对破伤风类毒素的以Arg1216为中心的区域具有特异性结合能力。


2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于，所述单链可变片段scFv由轻链可变区通过(GGGGs)n短肽和重链可变区相连接而成，其基本结构如VL一(GGGGs)3一VH；A链和B链的铰链区通过一个或多个二硫键相连接；A链人IgG1Fc片段和B链人IgG1Fc片段通过隆突一入一穴结构连接。


3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述A链、B链的scFv的轻链可变区和重链可变区是通过噬菌体展示技术筛选后获得的，是采用重组表达不同破伤风片段或突变体进行差异化筛选全人源化噬菌体免疫抗体库后得到的，获得如下序列：

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4.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于，所述A链的单链可变片段ScFv为如SEQIDNo.10所示的氨基酸序列；所述B链的单链可变片段ScFv为如SEQIDNo.12所示的氨基酸序列,并对Fc片段的CH3区域的氨基酸进行突变，一条链表达突变体S354C/T366W，一条链表达突变体Y349C/T366S/L368A/Y407V,从而形成隆突一入一穴，提高了异源化的抗体形成。


5.根据权利要求1-5任一项所述的全人源化抗破伤风双特异性抗体的构建方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
(1)分别将A链构建到第一表达载体上，将B链构建到第二表达载体上；
(2)将两种表达载体一起共转染到细胞中，培养并取上清；
(3)将表达上清分离得到纯化后的双特异性抗体，所述的分离步骤包括：亲和层析柱从表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鑫，饶深铖，范铁炯，孙九如，柏伟，
申请(专利权)人：上海赛伦生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31