一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，特点是包括分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息，剔除虾龄指示菌种的步骤；筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，确定多致病菌种类的步骤；筛选出ΔB<‑0.5且ASCH‑score>1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌的步骤；将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比的步骤；优点是准确性更高、稳定性更好。

A method of screening probiotic combination based on multi pathogenic bacteria of shrimp disease

【技术实现步骤摘要】
一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法
本专利技术涉及水产养殖动物益生菌筛选方法，尤其是涉及一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法。
技术介绍
随着我国对虾养殖业不断发展，养殖模式从土塘养殖转变为集约化、高密度的温棚和循环水养殖。这种转变导致应激原增多、对虾免疫力下降,致使对虾养殖病害问题日益突出。对虾病害具有发病快、死亡率高等特点，而目前缺乏特别有效的治疗方法。我国每年因对虾病害造成的损失高达数百亿元。目前对虾病害的预防和治疗仍广泛采用抗生素。抗生素的滥用造成环境污染，诱导高耐药性病原菌的产生，同时破坏了对虾正常的肠道菌群使其更易受病原菌的侵染，最终通过食物链富集威胁到人类健康。利用自然环境中有益益生菌对水产养殖环境的生物修复，以此可部分取代抗生素的使用，同时减少养殖过程的换水频率。现有商业化益生菌剂的设计缺乏科学依据，主要由芽孢杆菌和乳酸菌(人肠道益生菌)组成。然而，上述二种菌株在对虾肠道菌群中含量极低，甚至未检测到，表明不适宜在对虾肠道中定殖。由于宿主对肠道菌群的选择性，添加的商业益生菌未能持续成功地在对虾肠道中存活，因而未发挥预期的益生效果甚至无效。近期研究表明部分对虾养殖病害是多病原菌协同作用造成的，传统科赫法则（Koch'spostulates）从发病对虾中分离到的菌株（高丰度的菌容易被分离到）有时并不能准确地反推出致病菌；同时多病原菌在侵染顺序和比例未知的前提下，难以在实验室依据科赫法则回复侵染宿主验证。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种准确性高的基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，包括以下步骤：（1）首先采用Illumina高通量测序方法分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息；（2）抽取对虾血液测定超氧化物歧化酶(SOD)浓度判断病害严重程度，即测定对虾血清中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度；（3）筛选健康对虾生长过程中的虾龄指示菌种，从肠道细菌群落数据中剔除虾龄指示菌种，消除随生长阶段的本底变化；（4）比较健康对虾和病害对虾肠道细菌组成动态差异，筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，将多致病菌特征序列通过与病原菌数据库比对确定多致病菌种类；（5）计算最后一个时间分组的病害组中所有细菌的驱动种生态特征值ΔB和ASCH分值，筛选出ΔB<-0.5且ASCH-score>1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌；（6）分别计算几种益生菌在最后一时间分组的健康组对虾肠道中的相对丰度比例，将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比。步骤（5）中驱动种生态特征值ΔB的计算方法如下：（1）其中Bscaled表示某一多致病菌在某一时间点的居中性数值，细菌节点居中性值是指细菌作为两个相互关联菌种的中间“桥梁”作用的次数，数值越大代表越重要；Bmin表示该时间点所有样本中该细菌的最小居中性数值；Bmax表示该时间点所有样本中该细菌的最大居中性数值；Bcalculated表示该时间点所有样本中该细菌的居中性平均值；ΔB=Bscaled(D)―Bscaled(H)（2）；Bscaled（H）表示在所有时间分组中，某一多致病菌在初始健康组中的居中性数值；Bscaled(D)表示由初始健康组转变过来的最后时间分组中的病害组中，该细菌在该病害组中的居中性数值。步骤（5）中ASCH分值计算方法如下：（3）其中ASCH分值，即ASCHH-D表示对虾样本从健康到病害转变过程中，菌群种间互作关系的共有菌种节点的变化评分数值，其中H表示健康，D病害；INBA（InteractingBacteria）表示多致病菌的高度关联菌种，其定义为利用采集的健康组和病害组细菌相对丰度与多致病菌相对丰度进行皮尔森相关性分析，r>0.7且P<0.05或r<-0.7且P<0.05的细菌即为高度关联菌种；[INBA]H表示所有时间样本分组中，最后一个时间分组的健康组和病害组菌群种间互作关系中的共有菌种与最后一个时间分组的健康组中高度关联菌种集合的菌种数量；[INBA]D表示所有时间样本分组中，最后一个时间分组的健康组和病害组菌群种间互作关系中的共有菌种与最后一个时间分组的病害组中高度关联菌种集合的菌种数量；[INBA]H∩[INBA]D表示[INBA]H集合和[INBA]D集合的交集中的菌种数量；[INBA]H∪[INBA]D表示[INBA]H集合和[INBA]D集合的并集中的菌种数量；[INBA]D−[INBA]H表示[INBA]D集合和[INBA]H集合的相对补集中的菌种数量，即属于[INBA]D集合而不属于[INBA]H集合的菌种数量；MDinD，MaximumDirectivityinD（MD）表示最后一个时间分组的病害组中多致病菌的个体数量。所述的多致病菌的组成如下：管氏弧菌（Vibriotubiashii）、河流弧菌珊瑚弧菌（Vibriofluvialis）、珊瑚弧菌（Vibriocoralliilyticus）。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了一种基于对虾病害致病菌定向鉴定并设计益生菌组合的方法，通过细菌相对丰度动态比较，去除对虾健康状态下的生长虾龄指示菌种后再筛选对虾多致病菌，从而消除了因对虾生长肠道菌群本底变化对筛选多致病菌的影响，进一步通过驱动种生态特征值鉴定多致病菌，极大地提高了鉴定多致病菌的准确性；针对对虾多致病菌由多菌种组成的特点，从菌种互作角度分析肠道菌群与多致病菌的关联，同时将直接拮抗病原菌的肠道共生菌精简到数株菌，分离拮抗菌，能够验证特定菌株与病害抗性的因果关系，实现定向设计益生菌组合，是一种低成本、快速的鉴定益生菌群的技术，提高经济效益、降低对虾养殖的风险，弥补了目前采用抗生素治疗水产动物病害的现状。附图说明图1为多致病菌相对丰度变化示意图。具体实施方式以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。具体实施例在凡纳滨对虾养殖后期，放苗77，84，87和93天后从6个养殖塘中采集样品。放苗84天后，在监测的6个养殖塘中有3个养殖塘对虾发病，并且随着时间的推移疾病的严重程度增加，死亡率线性增加。我们同时采集了健康和病害对虾样品，共计61个样品。基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，如图1所示，包括以下步骤：1、样本经DNA提取、PCR扩增细菌16SrRNA基因，通过Illumina双末端高通量测序得到各对虾样本的肠道细菌群落本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，其特征在于包括以下步骤：/n（1）首先采用Illumina高通量测序方法分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息；/n （2）抽取对虾血液测定超氧化物歧化酶浓度判断病害严重程度，即测定对虾血清中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度；/n（3）筛选健康对虾生长过程中的虾龄指示菌种，从肠道细菌群落数据中剔除虾龄指示菌种，消除随生长阶段的本底变化；/n（4）比较健康对虾和病害对虾肠道细菌组成动态差异，筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，将多致病菌特征序列通过与病原菌数据库比对确定多致病菌种类；/n（5）计算最后一个时间分组的病害组中所有细菌的驱动种生态特征值ΔB和ASCH分值，筛选出ΔB<-0.5且ASCH-score>1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌；/n（6）分别计算几种益生菌在最后一时间分组的健康组对虾肠道中的相对丰度比例，将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）首先采用Illumina高通量测序方法分别获得不同时间节点健康对虾和对应时间点病害对虾的肠道细菌群落组成和丰度信息；
（2）抽取对虾血液测定超氧化物歧化酶浓度判断病害严重程度，即测定对虾血清中超氧化物歧化酶和溶菌酶活性，结合对虾病症和死亡率划分对虾疾病严重程度；
（3）筛选健康对虾生长过程中的虾龄指示菌种，从肠道细菌群落数据中剔除虾龄指示菌种，消除随生长阶段的本底变化；
（4）比较健康对虾和病害对虾肠道细菌组成动态差异，筛选初始健康状态下未定植于对虾肠道，但是随着对虾病害恶化相对丰度呈线性增长且其丰度显著高于对应时间点健康对虾的细菌类群，定义为多致病菌，将多致病菌特征序列通过与病原菌数据库比对确定多致病菌种类；
（5）计算最后一个时间分组的病害组中所有细菌的驱动种生态特征值ΔB和ASCH分值，筛选出ΔB<-0.5且ASCH-score>1.5的菌种为多致病菌的直接拮抗菌种，定义为益生菌；
（6）分别计算几种益生菌在最后一时间分组的健康组对虾肠道中的相对丰度比例，将单个益生菌相对丰度占所有益生菌相对丰度之和的比值作为相应益生菌的个体数量百分比，最终确定益生菌的组合和配比。


2.根据权利要求1所述的一种基于对虾病害多病源菌筛选益生菌组合的方法，其特征在于步骤（5）中驱动种生态特征值ΔB的计算方法如下：

（1）
其中Bscaled表示某一多致病菌在某一时间点的居中性数值，细菌节点居中性值是指细菌作为两个相互关联菌种的中间“桥梁”作用的次数，数值越大代表越重要；
Bmin表示该时间点所有样本中该细菌的最小居中性数值；
Bmax表示该时间点所有样本中该细菌的最大居中性数值；
Bcalculated表示该时间点所有样本中该细菌的居中性平均值；
ΔB=Bscaled(D)―Bscaled(H)（2）；
Bscaled（H）表示在所有时间分组中，某一多致病菌在初始健康组中的居中性...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊金波，陆嘉祺，宣丽霞，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33