一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法技术

本发明专利技术公开一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：病原菌的分离、纯化；病原菌的接种和再分离；待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；病原菌的分子鉴定四个步骤。本发明专利技术通过准确鉴定高丹草叶斑病病原菌，技术人员结合不同栽培区域分离到病原菌种类及主要优势病原菌种群，来建立相应的防控方法。本发明专利技术采用高速匀浆机匀浆，能够使菌丝均匀断裂，使菌丝在菌悬液中菌丝分布均匀。

Method for separating and identifying pathogenic bacteria of rice leaf spot disease

The invention discloses a method for isolation and identification of high pathogenic bacteria grass Dan leaf spot disease, which comprises the following steps: isolation and purification of pathogenic bacteria; pathogen inoculation and re separation; to be stable after the symptoms of disease, collected disease samples, and isolated pathogenic bacteria isolates, obtained are consistent with the original isolate; pathogenic bacteria molecular identification of four steps. The present invention establishes the corresponding prevention and control method through the accurate identification of the pathogen of the leaf spot disease of the high leaf spot, the technical personnel combined with different cultivation areas to separate the pathogenic bacteria species and the dominant pathogenic bacteria groups. The present invention adopts high speed homogenizer to make the hyphae break even, and the mycelium is distributed evenly in the suspension.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病原菌检测领域，涉及高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法。
技术介绍
高丹草（Sorghum bicolor × Sorghum sudanense）是高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）与苏丹草（Sorghum sudanense (Piper) Stapf.）种间杂交产生的杂种类型，属于高光效C4植物，是一种以利用茎叶为主的一年生禾本科饲用作物。高丹草表现出了显著的杂种优势，它同时结合了高粱抗寒、抗旱、耐倒伏、产草量高等特性和苏丹草分蘖性和再生性强、营养价值高、适口性好等优良特性。目前，高丹草在我国东北、西北、华北以及长江以南地区都有广泛种植，特别在我国西南农区，高丹草是夏季主要种植的牧草种类之一。叶斑病是禾本科饲草普遍发展的病害之一，主要危害饲草的叶片和叶鞘，对饲草的产量和品质造成了严重的损坏致使饲草短缺。而目前叶斑病尚无特定的药物进行防治，生产上还不能有效控制发生蔓延。而且目前关于高丹草叶斑病研究报道较少，仅在高粱及苏丹草上有相关的报道，所以关于其病原尚不清楚，一定程度上阻碍了高丹草叶斑病病原生物学特性、药剂筛选、病害防治、抗病育种等深入研究。在实现本专利技术过程中，专利技术人发现现有技术中至少存在如下问题：已有的研究表明高梁和苏丹草叶斑病的致病菌较为复杂，多达20多种，在其亲本高粱及苏丹草中已报道的叶斑病主要类型中包括弯孢菌（Curvularia sp.）、蠕孢菌（Bipolaris sp.）、链格孢菌（Alternaria sp.）等。另外，由于叶斑病致病机理较为复杂，不同种植区域的优势病原菌也表现出不同，如在新疆、甘肃等地的苏丹草叶斑病病原菌均不同。即使是在同一地区，苏丹草叶斑病的优势病原菌也可能不同，如对南京地区的苏丹草叶斑病病原菌分离得到有新月弯孢菌和平脐蠕抱菌。所以这些研究都表明了高丹草叶斑病病原菌种类的复杂和多样，为高丹草叶斑病的防治造成干扰。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术目的在于提供一种高效、准确鉴定高丹草叶斑病病原菌的方法。专利技术人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本专利技术提供的技术方案是，提供一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，包括以下步骤：a）病原菌的分离、纯化采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接部，依次经第一酒精溶液表面消毒、次氯酸钠表面消毒、无菌水冲洗，采用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，恒温恒湿培养；待病斑组织长出菌丝、菌落扩展，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，恒温恒湿培养；b）病原菌的接种和再分离采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用第二酒精溶液表面消毒，机械损伤叶表；将步骤a）分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆，粉碎菌丝，稀释菌丝悬浮液，吸取菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，叶片保湿培养，观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；c）待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；d）病原菌的分子鉴定将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。根据本专利技术高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述第一酒精溶液为75%酒精水溶液。根据本专利技术高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述第二酒精溶液为70%酒精水溶液。根据本专利技术高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述步骤b）中，粉碎菌丝至能用血球计数板计数。根据本专利技术高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个具体实施方式，其特征在于，具体步骤如下：a）病原菌的分离、纯化采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接处直径约5mm的小块，用75%酒精表面消毒10s，再经5%次氯酸钠表面消毒3m，再用无菌水冲洗三次，无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，每皿4片，25℃恒温恒湿培养；待病斑组织长出菌丝、菌落直径扩展约1cm时，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，25℃恒温恒湿培养；b）病原菌的接种和再分离田间采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用70%酒精表面消毒，用灭过菌的剪刀刺伤叶片，将分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆；粉碎菌丝至能用血球计数板计数，稀释菌丝悬浮液至含菌丝段1×106CFU/ml，吸取150μL菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，每叶片接种三点，每个菌接种6片叶片，叶片保湿培养，6天后观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；c）待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；d）将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。根据本专利技术高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法的一个实施方式，所述高速匀浆机匀浆30s-60s。与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：a)本专利技术通过准确鉴定高丹草叶斑病病原菌，技术人员结合不同栽培区域分离到病原菌种类及主要优势病原菌种群，来建立相应的防控方法。b)本专利技术采用高速匀浆机匀浆，能够使菌丝均匀断裂，使菌丝在菌悬液中菌丝分布均匀。c)本专利技术通过制备均匀菌悬液能够使高丹草叶片专利技术均匀，保证鉴定结果的准确性。d)本专利技术高丹草叶斑病病原菌的鉴定方法简单、快速、准确。附图说明图1是本专利技术实施例分离到部分病原菌菌落形态图。图2是基于ITS序列的供试病原菌NJ系统发育树。具体实施方式下面结合一个具体实施例进行说明。为使本专利技术实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施方式中的附图，对本专利技术实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本专利技术一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本专利技术中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本专利技术保护的范围。高丹草叶斑病是国内外高丹草种植区最常见的病害，此病自幼苗至成株期均可发生，主要危害叶片和叶鞘；病斑紫红色，呈长方形或梭形；病斑扩展受叶脉限制，病健交界明显；严重时，病斑连成片，使叶片枯死。而且该病潜伏期短，来势快，造成严重危害。本实施例是在叶斑病暴发期，从四川省农业科学院土壤肥料研究所资阳试验地、新都试验地采集高丹草病叶30份，分别进行编号并带回实验室进行分离鉴定。1、病原菌的分离、纯化采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接处直径约5mm的小块，用75%酒精表面消毒10s，再经5%次氯酸钠表面消毒3m，再用无菌水冲洗三次，无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，每皿4片，25℃恒温恒湿培养。待病斑组织长出菌丝、菌落直径扩展约1cm时，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，25℃恒温恒湿培养。2、病原菌的接种和再分离田间采集健康高本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：病原菌的分离、纯化采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接部，依次经第一酒精溶液表面消毒、次氯酸钠表面消毒、无菌水冲洗，采用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，恒温恒湿培养；待病斑组织长出菌丝、菌落扩展，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，恒温恒湿培养；病原菌的接种和再分离采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用第二酒精溶液表面消毒，机械损伤叶表；将步骤a）分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆，粉碎菌丝，稀释菌丝悬浮液，吸取菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，叶片保湿培养，观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；病原菌的分子鉴定将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。

【技术特征摘要】
1.一种高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：病原菌的分离、纯化采用组织分离法选择典型病斑，剪取病健交接部，依次经第一酒精溶液表面消毒、次氯酸钠表面消毒、无菌水冲洗，采用无菌吸水纸吸干叶片表面水分，置于含链霉素的PDA平板上，恒温恒湿培养；待病斑组织长出菌丝、菌落扩展，挑取菌落尖端菌丝移至PDA平板上，恒温恒湿培养；病原菌的接种和再分离采集健康高丹草叶片，室内将要接种的叶片用第二酒精溶液表面消毒，机械损伤叶表；将步骤a）分离到的真菌采用液体培养收集菌丝，高速匀浆机匀浆，粉碎菌丝，稀释菌丝悬浮液，吸取菌丝悬浮液接种至新鲜高丹草叶片上，叶片保湿培养，观察接种点叶片变化情况，以不接种叶片保湿培养对对照；待病害症状稳定后，采集病样，再分离病原菌，获取与原分离物一致的分离物；病原菌的分子鉴定将步骤c）获取到的病原菌接种至铺有玻璃纸的PDA培养皿中，带菌落扩展至整个培养皿，用无菌药匙刮取菌丝，应用真菌DNA提取试剂盒提取DNA，以引物IT4/IT5 PCR扩增目的片段，对扩增产物进行测序获得产物序列；将获得序列与Genbank中已有序列进行比对，获得分离物种属信息。2.根据权利要求1所述的高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述第一酒精溶液为75%酒精水溶液。3.根据权利要求1所述的高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述第二酒精溶液为70%酒精水溶液。4.根据权利要求1所述的高丹草叶斑病病原菌的分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤b）中，粉碎菌丝至能...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱永群，黄小琴，林超文，许文志，陈仕勇，王谢，姚莉，
申请(专利权)人：四川省农业科学院土壤肥料研究所，
类型：发明
国别省市：四川;51