新型三磷酸腺苷生物发光测定方法及其用途技术

本发明专利技术公开一类新型三磷酸腺苷生物发光测定方法，其特征在于在荧光素酶催化的生物发光反应体系中，含有辅酶A改善三磷酸腺苷检测的定量线性，含有卵清蛋白减慢生物发光信号衰减，从而显著提高了三磷酸腺苷生物发光测定方法的准确性。同时能够将这类新型三磷酸腺苷生物发光测定方法应用于血小板释放三磷酸腺苷的定量测定和血小板活化抑制剂的高通量筛选。

A new bioluminescence method for the determination of adenosine triphosphate and its application

【技术实现步骤摘要】
新型三磷酸腺苷生物发光测定方法及其用途
本专利技术涉及一类新型三磷酸腺苷(ATP)生物发光测定方法及其在血小板释放ATP测定及血小板活化抑制剂高通量筛选中的应用，属于生物

技术介绍
ATP是一种广泛存在于各种生物细胞中的有机化合物，能够为很多的酶催化反应提供能量，是生命活动必不可少的物质。ATP浓度检测被广泛应用于细胞损伤分析和微生物污染分析。在人体和哺乳动物血小板中，含有阿尔法颗粒和致密颗粒，致密颗粒中包含ATP和多种促凝物质。当血小板受到凝血酶、胶原、二磷酸腺苷(ADP)和血栓烷A2等激动剂刺激，会释放致密颗粒中的ATP和其它促凝物质。通过定量检测血小板ATP的释放可以监测血小板的活化。目前用于ATP定量检测的方法包括生物发光法、荧光法和比色法等各种方法，其中基于萤火虫荧光素酶催化的生物发光法由于具有高特异性和灵敏度，最常用于ATP的定量检测和血小板活化的监测。在镁离子和合适的缓冲液条件下，荧光素酶催化ATP和虫荧光素(luciferin，LH2)发生反应生成虫荧光素单磷酸腺苷(luciferin-AMP，LH2-AMP)，LH2-AMP进一步被氧气氧化为氧化虫荧光素(oxyluciferin)，并产生单磷酸腺苷(AMP)、二氧化碳、焦磷酸和释放光子。在荧光素酶和虫荧光素过量的条件下，可以通过荧光素酶催化反应定量检测ATP的浓度。然而在荧光素酶催化的反应中，会产生脱氢虫荧光素单磷酸腺苷(dehydroluciferyl-AMP，L-AMP)副产物，L-AMP是一种强烈的荧光素酶催化反应的抑制剂，对荧光素酶半数抑制浓度IC50约为6nM(BiochemBiophResCo，1997，237：445-450；FEBSLett，1998，438：190-194；FEBSJ，2005，272：5206-5216)。因此，在ATP生物发光测定中，随着ATP浓度增高，产生L-AMP的速度和量迅速增加，从而对酶反应发挥抑制作用，导致ATP定量测定线性不佳。另外，在ATP生物发光测定中，由于ATP在反应中的消耗，生物发光衰减速度较快，从而导致加入各种试剂的时间误差会严重影响测定的准确性，特别是血小板活化测定中，这种信号衰减使ATP定量测定很难用于96孔板或384孔板为基础的血小板活化抑制剂的高通量筛选。在1958年，有研究者发现辅酶A(CoenzymeA，CoA)能够增强荧光素酶催化的酶反应，并认为辅酶A可能能够与酶反应生成的抑制性产物反应从而减轻抑制性产物对酶反应的抑制(BiochimicaEtBiophysicaActa，1958，27：519-532)。经过后续的研究，研究者进一步发现辅酶A可以和L-AMP反应生成脱氢虫荧光素辅酶A(L-CoA)，L-CoA是一种很弱的荧光素酶活性抑制剂，其半数抑制浓度IC50约为5μM(FEBSJ，2005，272：5206-5216)。因此，辅酶A加入荧光素酶反应体系中，可以大大减轻抑制性产物L-AMP对反应的抑制。在部分商业荧光素酶报告基因表达检测试剂盒中，由于ATP和虫荧光素是过量的，而荧光素酶是不足量的，L-AMP对荧光素酶催化活性的抑制导致生物发光信号迅速衰减，辅酶A常被添加到反应体系中减慢发光信号衰减，提高荧光素酶报告基因表达检测的准确度。然而，在ATP生物发光检测中，由于ATP的消耗是信号衰减的主要原因，还没有研究者或商品试剂盒将辅酶A添加到检测体系中，本专利技术发现将辅酶A添加到ATP生物发光检测体系中，可以减轻高浓度ATP的生物发光反应产生的抑制性产物对酶反应的抑制，从而改善ATP定量检测的线性。另外在专利技术人进行血小板释放ATP的生物发光检测过程中，偶然发现改良台式液中添加卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)能够显著减缓生物发光信号的衰减。本专利技术人通过系统研究，发现经过浓度优化的卵清蛋白可以在ATP生物发光检测中同时增强荧光素酶催化的生物发光效率和减慢反应速度，从而在不减弱生物发光信号的条件下，显著减慢ATP消耗导致的生物发光信号衰减，进而消除试剂加入时间误差导致的ATP检测误差，使ATP生物发光分析能够用于血小板抑制剂的高通量筛选。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种ATP生物发光检测方法，其利用反应体系中添加辅酶A来改善ATP定量线性，提高检测的准确度。本专利技术另一目的是提供一种ATP生物发光检测方法，其利用反应体系中添加卵清蛋白来减慢生物发光信号的衰减，降低试剂加入时间差异带来的测定误差，提高检测的准确度。本专利技术又一目的是提供一种ATP生物发光检测方法，其利用反应体系中添加辅酶A来改善ATP定量线性，同时添加卵清蛋白来减慢生物发光信号的衰减，共同提高检测的准确度。本专利技术的再一目的在于提供上述准确灵敏的ATP生物发光检测方法在血小板活化检测和血小板活化抑制剂高通量筛选中的应用。本专利技术通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸缓冲液(25mMN-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸，5mM硫酸镁，0.1mM乙二胺四乙酸，pH7.8)中进行ATP生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mM虫荧光素、1mM二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，证明添加辅酶A到ATP生物发光检测体系中至终浓度3.9μM到62.5μM，能够最大程度增强生物发光反应，优选该浓度范围辅酶A显著改善ATP生物发光检测定量线性。本专利技术通过Hank’s平衡盐溶液(137mM氯化钠，5.33mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，0.44mM磷酸二氢钾，4.17mM碳酸氢钠，5.56mM葡萄糖，0.41mM硫酸镁，0.49mM氯化镁and1.26mM氯化钙，pH7.3)和改良台式液(137mM氯化钠，2.9mM氯化钾，0.34mM磷酸氢二钠，12mM碳酸氢钠，5mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸，5mM葡萄糖，1mM氯化镁and1mM氯化钙，pH7.3)中进行ATP生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mM虫荧光素、1mM二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，进一步证明添加辅酶A到ATP生物发光检测体系中，能够显著改善ATP生物发光检测线性。本专利技术通过N-三(羟甲基)甲基甘氨酸-盐酸缓冲液、Hank’s平衡盐溶液和改良台式液中进行ATP生物发光检测，反应体系中同时包括0.5mM虫荧光素、1mM二硫苏糖醇、1.25μg/ml荧光素酶，证明添加卵清蛋白到ATP生物发光检测体系中，至终浓度0.0156％到0.25％，能够在增强生物发光强度的基础上，最大程度上减慢生物发光信号的衰减，优选该浓度范围卵清蛋白用于ATP生物发光检测，提高检测准确度。本专利技术通过辣根过氧化物酶的化学发光分析，发现卵清蛋白不仅不能减慢辣根过氧化物酶化学发光信号衰减，还会降低化学发光强度，证明卵清蛋白增强荧光素酶催化的生物发光强度具有特异性。本专利技术优选在Hank’s平衡盐溶液和改良台式液中添加辅酶A和卵清蛋白进行血小板活化刺激和释放ATP的生物发光检测，证明本专利技术提供的ATP生物发光检测能够检测血小板的活化。本专利技术优选Hank’s平衡盐溶液和改良台式液中添加辅酶A和卵清蛋白进行血本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种准确灵敏的三磷酸腺苷生物发光检测方法，其特征在于，在检测体系中，含有辅酶A，辅酶A改善了三磷酸腺苷测定的定量线性。/n

【技术特征摘要】
1.一种准确灵敏的三磷酸腺苷生物发光检测方法，其特征在于，在检测体系中，含有辅酶A，辅酶A改善了三磷酸腺苷测定的定量线性。


2.一种准确灵敏的三磷酸腺苷生物发光检测方法，其特征在于，在检测体系中，含有卵清蛋白，卵清蛋白减慢了三磷酸腺苷测定的生物发光信号衰减。


3.一种准确灵敏的三磷酸腺苷生物发光检测方法，其特征在于，在检测体系中，含有辅酶A和卵清蛋白，辅酶A改善了三磷酸腺苷测定的定量线性，卵清蛋白减慢了三磷酸腺苷测定的生物发光信号衰减。


4.权利要求1和3所述的三磷酸腺苷生物发光检测方法，其特征在于，在检测体系中...

【专利技术属性】
技术研发人员：屠鹏飞，朱枝祥，王丽丽，李军，李芸芊，郭冉，李珊珊，
申请(专利权)人：北京中医药大学，
类型：发明
国别省市：北京;11