蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用制造技术

本发明专利技术提供了蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用。本发明专利技术是利用敲除或突变蛋白酶基因部分碱基或减弱蛋白酶基因的表达的微生物菌株，提升降解木质纤维素或是生产纤维素酶、半纤维素酶能力，所述微生物为毁丝霉、曲霉、木霉、青霉、镰刀霉，所述蛋白酶基因包括MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。同时，通过把这组蛋白酶基因重组过表达，可以帮助重组微生物利用复杂氮源，生长更好，可在产品发酵中应用。

Application of protease gene in promoting cellulase production and utilization of complex nitrogen sources

【技术实现步骤摘要】
蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用
本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用。
技术介绍
木质纤维素是自然界中一种丰富的可再生资源，主要由碳水化合物聚合物(纤维素和半纤维素)和芳香族化合物的聚合物(木质素)组成。木质纤维素的利用需要通过酶解液化和糖化发酵两个基本步骤。其中，酶解过程中所需要的木质纤维素水解酶(纤维素酶、半纤维素酶等)的生产成本过高，已成为制约整个生物炼制产业发展的核心问题。如何高效、廉价的生产这些酶制剂或是如何低成本地将生物质高效地降解为可发酵的单体化合物(葡萄糖、木糖等)、低聚化合物(纤维寡糖、木寡糖等)已成迫切需要解决的问题。在自然界中，多种微生物都具有降解、利用纤维素的能力，特别是子囊菌和担子菌等丝状真菌可以分泌多种木质纤维素水解酶，与其它微生物相比，其具有完整的纤维素酶系。同时，丝状真菌具有强大的蛋白质分泌能力，而且丝状真菌表达的异源蛋白质会经历糖基化和蛋白质折叠等真核翻译后修饰，这些特性使其成为研究纤维素利用，纤维素酶等蛋白质生产中的热点。参与丝状真菌蛋白质表达分泌的基因众多，其中蛋白酶对蛋白质的降解特性是工业酶生产表达中的一个瓶颈，成为工业酶高产的限制因素。目前，丝状真菌作为工业酶生产宿主受到越来越多的关注，因此，建立丝状真菌纤维素酶等蛋白质高效表达系统具有重要意义与价值。另一方面，豆粕等复杂氮源是微生物发酵中常用的氮源，但由于含有复杂蛋白质，而不是简单多肽和氨基酸，很多微生物直接利用豆粕效果不佳，使得豆粕在部分微生物发酵中不能广泛应用，限制了这一廉价氮源使用，从而抬高整个发酵成本。因此，本领域迫切需要建立丝状真菌纤维素酶高效表达系统和复杂氮源利用系统。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供蛋白酶基因在促进纤维素酶生产和复杂氮源利用中的应用。本专利技术的第一方面，提供了一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，包括步骤：抑制丝状真菌的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性；其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或所述的蛋白酶基因包括：(1)序列如SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。在另一优选例中，所述抑制包括敲除和/或下调所述的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性。在另一优选例中，所述提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达包括：(a)提高纤维素酶和/或半纤维酶的表达；和/或(b)减少纤维素酶和/或半纤维酶的降解。在另一优选例中，所述丝状真菌选自下组：曲霉(Aspergillus)、木霉(Trichoderma)、青霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium)、或毁丝霉(Myceliophthora)。在另一优选例中，所述丝状真菌为毁丝霉，较佳地，为嗜热毁丝霉。在另一优选例中，所述的蛋白酶还包括：(ii)将如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或(iii)氨基酸序列与SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的蛋白酶基因还包括：(2)核苷酸序列与SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的蛋白酶基因选自下组：cDNA序列、基因组序列、或其组合。在另一优选例中，所述蛋白酶基因选自下组中的一个或多个：MYCTH_2303011、MYCTH_2308737、MYCTH_2295424、MYCTH_111035和MYCTH_2308168。在另一优选例中，所述的蛋白酶基因至少包括序列如SEQIDNO.:1所示的多核苷酸(MYCTH_2303011)；和/或所述的蛋白酶至少包括序列如SEQIDNO.:2所示的多肽(MYCTH_2303011)。在另一优选例中，所述的蛋白酶基因至少包括序列如SEQIDNO.:3所示的多核苷酸(MYCTH_2308737)；和/或所述的蛋白酶至少包括序列如SEQIDNO.:4所示的多肽(MYCTH_2308737)。在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2303011的核苷酸序列如SEQIDNO.:1所示，编码序列如SEQIDNO.:2所示的蛋白。在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2308737的核苷酸序列如SEQIDNO.:3所示，编码序列如SEQIDNO.:4所示的蛋白。在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2295424的核苷酸序列如SEQIDNO.:5所示，编码序列如SEQIDNO.:6所示的蛋白。在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_111035的核苷酸序列如SEQIDNO.:7所示，编码序列如SEQIDNO.:8所示的蛋白。在另一优选例中，所述蛋白酶基因MYCTH_2308168的核苷酸序列如SEQIDNO.:9所示，编码序列如SEQIDNO.:10所示的蛋白。本专利技术的第二方面，提供了一种蛋白酶、或蛋白酶基因、或其抑制剂的用途，用于：(a)调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或(b)调控丝状真菌的纤维素降解活性；其中，所述的蛋白酶包括：(i)序列如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；(ii)将如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或(iii)氨基酸序列与SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；所述的蛋白酶基因包括：(1)序列如SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；(2)核苷酸序列与SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达包括调控纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或降解。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，其特征在于，包括步骤：/n抑制丝状真菌的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性；/n其中，所述的蛋白酶包括：/n(i)序列如SEQ ID NO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或/n所述的蛋白酶基因包括：/n(1)序列如SEQ ID NO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性的方法，其特征在于，包括步骤：
抑制丝状真菌的蛋白酶或蛋白酶基因的表达和/或活性，从而提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性、和/或提高丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或
所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。


2.一种蛋白酶、或蛋白酶基因、或其抑制剂的用途，其特征在于，用于：
(a)调控丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或
(b)调控丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；
(ii)将如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-10个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；和/或
(iii)氨基酸序列与SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示氨基酸序列的同源性≥50％(较佳地≥60％，更佳地≥80％或≥95％)，具有蛋白酶活性的由(i)衍生的多肽；
所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种；
(2)核苷酸序列与SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示核苷酸序列的同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％或≥98％)，且编码蛋白酶的多核苷酸；或
(3)与(1)或(2)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。


3.一种蛋白酶或蛋白酶基因的抑制剂的用途，其特征在于，用于：
(a)提高丝状真菌纤维素酶和/或半纤维酶的表达和/或活性；和/或
(b)提高丝状真菌的纤维素降解活性；
其中，所述的蛋白酶包括：
(i)序列如SEQIDNO.:2、4、6、8或10所示的多肽中的一种或多种；和/或
所述的蛋白酶基因包括：
(1)序列如SEQIDNO.:1、3、5、7或9所示的多核苷酸中的一种或多种。

【专利技术属性】
技术研发人员：田朝光，李晓林，李金根，赵军旗，刘倩，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津;12