一种降解AFB制造技术

本发明专利技术提供一种降解AFB

A degradation AFB

【技术实现步骤摘要】
一种降解AFB1的漆酶及其基因和应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种降解AFB1的漆酶及其基因和应用。技术背景黄曲霉毒素B1（AFB1）主要是由黄曲霉（Aspergillusflavus）和寄生曲霉（Aspergillusparasiticus）产生的次级有毒代谢产物，由双呋喃环和香豆素环组成，具荧光性，在紫外线下发出蓝光，是毒性最强的黄曲霉毒素，也是已知的最强的天然化学致癌物，其中呋喃环被认为具有毒性和致癌性。目前，全球有超过50亿人面临长期接触食品中AFB1的风险，因此，如何安全有效的去除AFB1是人类面临的共同问题。AFB1可通过物理、化学以及生物法降解，但物理方法耗时，且无法保障AFB1被完全清除；化学物质的使用虽然能显著降低AFB1浓度，但同时导致营养物质的损失，降低食品或饲料质量；直接使用微生物体降解AFB1，也会损害产品的感官特性，且降解过程的安全性无法保证。酶具有底物特异性、有效高、环境友好的特点，被广泛应用于食品和饲料工业，所以最安全有效的方法是选用特定的酶来降解AFB1。目前，已知的可降解AFB1的纯酶包括黄曲霉素氧化酶（AFO,Armillariellatabescens）,过氧化物酶（Armoraciarusticana）,F420H2依赖型还原酶（FDR,Mycobacteriumsmegmatis）,锰过氧化物酶（MnP,Pleurotusostreatus）和漆酶（Bacillussubtilis,Trametesversicolor,Pleurotuspulmonarius）。AFO是从细胞内提取物中分离得到的唯一一种AFB1降解酶，与AFB1有很强的亲和力,该酶可将AFB1分子结构中的双呋喃环断裂，并且该降解过程为氧气依赖型，可同时产生过氧化氢，且过氧化氢在AFO的脱毒过程中起着重要作用；而源于Mycobacteriumsmegmatis的F420H2依赖型还原酶（FDR）则与之相反，对AFB1的亲和力低于AFO，但具有较高的催化活性，FDR-A催化AFB1中的α,β-不饱和酯键，激活AFB1自发水解生成一种新的降解产物；从白腐真菌Pleurotusostreatus和Phanerochaetesordida中纯化的锰过氧化物酶（MnP）也能降解AFB1，其原理是MnP首先将AFB1转化成AFB1-8,9-环氧化合物，然后AFB1-8,9-环氧化合物再水解成为AFB1-8,9-二氢二醇。这些酶在AFB1分子上可能有不同的靶点，不同的活性位点导致AFB1降解产物的多样性。以上几种酶降解AFB1的机制都得到解析，但至今为止，关于漆酶降解AFB1的机制依然未知。漆酶（EC1.10.3.2）是含铜多酚氧化酶，能催化底物分子氧化为相应的活性自由基，同时将氧还原为水。最近研究表明漆酶能将一些环境污染物和毒素，如酚类、氧化烯烃、咔唑类、芴类、二苯并噻吩、多环芳烃等转化为无毒或毒性较低的产物。目前,已报道的能降解AFB1的漆酶有细菌来源Bacillussubtilis(BsCotA)（Accession：AID81987.1）；真菌来源：T.versicolor(Accession：CAA77015.1，PDBcode1KYA)，Pleurotuspulmonarius（Accession：AAX40733.1），Pleurotuseryngii（Accession：CAO79915.1），但可用于降解AFB1的Cerrenaunicolor漆酶尚未见报道。本专利通过纯化、转录组测序、蛋白质鉴定，克隆表达等方法，从Cerrenaunicolor中获得了一种降解AFB1的漆酶及其基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种降解AFB1的漆酶及其基因和应用。本专利技术源于Cerrenaunicolor的漆酶对AFB1降解效果好，应用价值巨大。为实现上述目的，采用以下技术方案：一种降解AFB1的漆酶，所述漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种编码降解AFB1的漆酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。一种含有编码降解AFB1的漆酶的基因的重组载体。进一步的，一种含有编码降解AFB1的漆酶的基因的重组载体为将编码降解AFB1的漆酶的基因连接至pPICZɑ-A载体上所得的重组载体pPICZɑ-A-Lac2。一种含有编码降解AFB1的漆酶的基因的细胞，所述细胞由含有编码降解AFB1的漆酶的基因的重组载体转化宿主细胞而得；优选的所述宿主细胞为毕氏酵母。一种含有编码降解AFB1的漆酶的基因的细胞表达的重组漆酶。一种降解AFB1的漆酶在降解AFB1中的应用。一种含有编码降解AFB1的漆酶的基因的细胞表达的重组漆酶在降解AFB1中的应用。具体为：本专利技术从一色齿毛菌（Cerrenaunicolor）中分离纯化能降解AFB1的漆酶及克隆漆酶基因。本专利技术通过对一色齿毛菌（Cerrenaunicolor）菌株的转录组RNA进行测序分析，得到漆酶cDNA序列，构建Cerrenaunicolor漆酶库；通过对菌株Cerrenaunicolor的发酵上清液进行分离纯化得到纯漆酶，对该纯漆酶进行UHPLC-MS/MS鉴定，与Cerrenaunicolor漆酶库进行比对，得到降解AFB1的漆酶cDNA序列；设计特异性引物，以菌株Cerrenaunicolor提取到的RNA逆转录后的cDNA为模板克隆得到该漆酶基因。所述漆酶基因包含如SEQIDNO.1所示的核酸序列，称之为Lac2。本专利技术还涉及包含SEQIDNO.1所示核酸序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述SEQIDNO.1所示核酸序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。将带内源性信号肽的编码序列即本专利技术Lac2编码序列去除信号肽，再经EcoRI和XbaI双酶切后与EcoRI和XbaI双酶切的pPICZɑ-A载体连接，得到酵母重组表达载体pPICZɑ-A-Lac2。本专利技术制备了能够降解AFB1的漆酶，获得了优质的漆酶产品。本专利技术通过酶活测定，酶学性质分析，降解AFB1的分析，证明本专利技术的漆酶是一种具有降解AFB1能力的漆酶。本专利技术的优点在于：本专利技术的漆酶能用于降解AFB1，24h对AFB1的降解率将达100%。目前来源于Cerrenaunicolor且能降解AFB1的漆酶未见报道。本专利技术的漆酶及重组漆酶在AFB1的降解中有巨大应用价值。附图说明图1Cerrenaunicolor来源的漆酶的SDS-PAGE。M：蛋白质Marker；1：漆酶DEAE柱纯化产物。图2Cerrenaunicolor来源的漆酶的最适pH和pH稳定性。A：pH对漆酶的活性影响；B：漆酶的pH稳定性。图3Cerrenaunicolor来源的漆酶的最适温度和温度稳定性。A：温度对漆酶的活性影响；B：漆酶的温度稳定性。图4Cerrenaunicolor来源的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于降解AFB

【技术特征摘要】
1.一种用于降解AFB1的漆酶，其特征在于：所述漆酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.一种编码如权利要求1所述漆酶的基因，其特征在于：其基因序列如SEQIDNO.1所示。


3.一种含有如权利要求2所述基因的重组载体。


4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2所述的基因连接至pPICZɑ-A载体上所得的重组载体pPICZɑ-A-Lac2。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶秀云，周智敏，李仁宽，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35