一种超氧化物歧化酶的纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种超氧化物歧化酶的纯化方法，包括以下步骤：步骤一：取蚯蚓，使用清水对蚯蚓进行清洗，对蚯蚓进行吐泥处理；步骤二：将步骤一中的蚯蚓用组织捣碎匀浆机捣碎，经高速冷冻离心机离心分离，取离心液，即SOD提取液；步骤三：将SOD提取液进行不少于2次超滤，得到SOD纯化液；步骤四：配置缓冲液，用缓冲液稀释并配置浓度为2~100mg/ml的SOD溶液；步骤五：使用96种结晶试剂盒对步骤四中的SOD溶液进行结晶条件的筛选；步骤六：将步骤五中结晶试剂盒内的结晶溶液体系放置在20℃的温控箱中，结晶6~8天，收集结晶的蛋白质晶体，并冷冻保存。本发明专利技术制备的SOD具有纯度高，活性大的优点。

A purification method of superoxide dismutase

【技术实现步骤摘要】
一种超氧化物歧化酶的纯化方法
本专利技术涉及超氧化物歧化酶
，尤其涉及一种超氧化物歧化酶的纯化方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase简称SOD)是一种新型酶制剂，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质，SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫，广泛应用于生物、医药、化工等领域。例如，SOD在治疗肿瘤、炎症和抗衰老等方面均有重要的临床应用。研究人员发现，通过测定病人体内血清中的SOD活性的高低，可以对肺肿瘤病人疾病发展程度进行分析；可以将超氧化物歧化酶（SOD）制成制剂，作为阴茎纤维性海绵体炎疼痛期的治疗药物，具有安全、有效及相应的可控性；在自身性免疫病的治疗方面也可发挥重要作用，如在治疗红斑狼疮和系统性硬化病中，SOD能有效抑制病患者血清中的破坏因子，实现良好的治疗效果。虽然SOD拥有很好的抗氧化功能，具备广阔的应用前景，但从天然物质中提取的SOD的浓度低而较难应用，使得其在实际应用中受到了一定的限制。同时，SOD属于大分子的蛋白质，其以普通的状态存在时其较难保持其生物活性的完整而导致失活，但是已结晶结构存在的蛋白质的活性较为稳定。目前，蛋白质纯化方法主要途径包括分级盐析、凝胶层析、膜分离等，而蛋白质结晶途径则是一种较为传统的方法。通过结晶方法可以得到纯度、均一度、活性均极佳的蛋白质，是获取最高品质蛋白质样品的最佳途径之一。由于结晶过程难度较大，工艺复杂，必须研发出稳定的结晶工艺才可以实现规模生产。在现有实际的SOD工业生产中，尚未实现SOD的结晶纯化生产，亦尚未发展出具体的生产工艺。因此，如何提供一种纯度高、结晶好、生物活性稳定、规模化生产的SOD是亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中SOD的浓度低、稳定性差、极易失活、规模化生产程度低的问题，提供了一种超氧化物歧化酶的纯化方法。由于蚯蚓中SOD含量较高，且鉴于蚯蚓易于养殖、来源广泛、生物安全性高的特点，其可以作为规模化生产SOD的原料。实现专利技术目的的技术方案如下：一种超氧化物歧化酶的纯化方法，包括以下步骤：步骤一：取蚯蚓，使用清水对蚯蚓进行清洗，对蚯蚓进行吐泥处理，待蚯蚓吐泥完全后，取出，备用；步骤二：将步骤一中的蚯蚓用组织捣碎匀浆机捣碎，经高速冷冻离心机离心分离，取离心液，即SOD提取液，备用；步骤三：将SOD提取液进行不少于2次超滤，得到SOD纯化液，备用；步骤四：配置缓冲液，用缓冲液稀释SOD纯化液，配置浓度为2~100mg/ml的SOD溶液；步骤五：使用Hampton公司的IndexTM和CrystalScreen的96种结晶试剂盒对步骤四中的SOD溶液进行结晶条件的筛选；步骤六：将步骤五中结晶试剂盒内的结晶溶液体系放置在20℃的温控箱中，结晶6~8天，收集结晶的蛋白质晶体，并冷冻保存。其中，步骤四中，所述缓冲液的浓度为0.001～1M，pH为5～10。在本专利技术的一个优选实施例中，所述缓冲液包括但不限于Tris-Gly缓冲系统、磷酸、碳酸、醋酸、柠檬酸盐、磷酸盐、柠檬酸、巴比妥酸、硼酸盐。缓冲液能够在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱等对SOD溶液的酸碱度的影响，从而使SOD溶液的pH值能够维持相对稳定的状态。在本专利技术的一个优选实施例中，为了避免离心时离心液温度升高导致离心液内的SOD失活，在步骤二中，高速冷冻离心机离心温度为0~6℃，离心时间为5~30min。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤三中，SOD提取液包括2次超滤；一次超滤为：采用1#滤膜过滤SOD提取液，得SOD一次过滤液；二次超滤为：稀释SOD一次过滤液，静置12h，采用2#滤膜过滤SOD一次过滤液，得SOD二次过滤液，即为SOD纯化液；所述1#滤膜过滤的截留分子量为20KD，所述2#滤膜的截留分子量为10KD。通过对SOD提取液进行超滤，能够滤除SOD提取液内的大部分杂质，提高SOD提取液内的SOD纯度，从而确保结晶时结晶条件的筛选。在本专利技术的一个优选实施例中，为提高SOD提取液经蛋白质试剂盒结晶条件筛选的成功率，在步骤四中，配置的SOD溶液浓度为60~100mg/ml。在本专利技术的一个优选实施例中，步骤五中，96种结晶试剂盒中筛选的蛋白质结晶条件≥10种。与现有技术相比，本专利技术型的有益效果是：本专利技术通过从蚯蚓内提取SOD，并经过超滤后，再采用蛋白质试剂盒筛选结晶条件，从而提高SOD的纯度，并保证其活性。这种结晶纯化工艺不仅SOD的纯度高，同时保证其SOD的酶活高，其相对SOD传统工艺来说能源消耗低，在医药工业中具有广阔的前景。具体实施方式下面的各实施方式对专利技术进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本专利技术的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本专利技术的保护范围之内。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本专利技术创造的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。实施例1：本实施例提供一种超氧化物歧化酶的纯化方法，在本实施方式中，本实施例是从蚯蚓体内分离并经纯化及结晶得到Cu/Zn-SOD。Cu/Zn-SOD（超氧化物歧化酶）的纯化方法，包括以下步骤：步骤一：取赤子爱胜蚯蚓（Eiseniafoetida），使用清水对蚯蚓进行清洗，清洗赤子爱胜蚯蚓表面的泥、沙等污垢。并采用光照对赤子爱胜蚯蚓进行吐泥处理，待赤子爱胜蚯蚓吐泥完全后，取出，备用；步骤二：将步骤一中的赤子爱胜蚯蚓用组织捣碎匀浆机捣碎，经高速冷冻离心机在0~6℃，离心时间为5~30min的条件下进行离心分离，取离心液，即SOD提取液，备用；步骤三：将SOD提取液进行SOD提取液进行2次超滤，制得SOD纯化液，备用。两次超滤为：一次超滤：采用截留分子量为20KD的1#滤膜过滤SOD提取液，得SOD一次过滤液；二次超滤：稀释SOD一次过滤液，静置12h，采用截留分子量为10KD的2#滤膜过滤SOD一次过滤液，得SOD二次过滤液，即为SOD纯化液。通过对SOD提取液进行2次超滤，能够滤除SOD提取液内的大部分杂质，提高SOD提取液内的SOD纯度，经2次超滤后SOD纯化液内的SOD的酶活范围为1000~100000IU/G。步骤四：采用Tris-Gly缓冲系统配置浓度为0.001～1M，pH为5～10的缓冲液，用缓冲液稀释SOD纯化液，配置浓度为2~100mg/ml的SOD溶液。Tris-Gly缓冲液能够在一定程度上抵消、减轻外加强酸或强碱等对SOD溶液的酸碱度的影响，从而使SOD溶液的pH值能够维持相对稳定的状态。步骤五：使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种超氧化物歧化酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一：取蚯蚓，使用清水对蚯蚓进行清洗，对蚯蚓进行吐泥处理，待蚯蚓吐泥完全后，取出，备用；/n步骤二：将步骤一中的蚯蚓用组织捣碎匀浆机捣碎，经高速冷冻离心机离心分离，取离心液，即SOD提取液，备用；/n步骤三：将SOD提取液进行不少于2次超滤，得到SOD纯化液，备用；/n步骤四：配置缓冲液，用缓冲液稀释SOD纯化液，配置浓度为2~100mg/ml的SOD溶液；/n步骤五：使用Hampton公司的Index

【技术特征摘要】
1.一种超氧化物歧化酶的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取蚯蚓，使用清水对蚯蚓进行清洗，对蚯蚓进行吐泥处理，待蚯蚓吐泥完全后，取出，备用；
步骤二：将步骤一中的蚯蚓用组织捣碎匀浆机捣碎，经高速冷冻离心机离心分离，取离心液，即SOD提取液，备用；
步骤三：将SOD提取液进行不少于2次超滤，得到SOD纯化液，备用；
步骤四：配置缓冲液，用缓冲液稀释SOD纯化液，配置浓度为2~100mg/ml的SOD溶液；
步骤五：使用Hampton公司的IndexTM和CrystalScreen的96种结晶试剂盒对步骤四中的SOD溶液进行结晶条件的筛选；
步骤六：将步骤五中结晶试剂盒内的结晶溶液体系放置在20℃的温控箱中，结晶6~8天，收集结晶的蛋白质晶体，并冷冻保存，
其中，步骤四中，所述缓冲液的浓度为0.001～1M，pH为5～10。


2.根据权利要求1所述的一种超氧化物歧化酶的纯化方法，其特征在于，所述缓冲液包括但不限于Tris-Gly缓...

【专利技术属性】
技术研发人员：李瑾，尹大川，王媚，王露，赵鹏，
申请(专利权)人：陕西中医药大学，西安高德威尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61